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Previous issue date: 2006 / O setor industrial de produção de álcool combustível, como uma atividade
biotecnológica, ainda não experimentou o uso das novas tecnologias de
modificação genética nas células da levedura Saccharomyces cerevisiae, a qual
poderia contribuir para o aumento do rendimento de etanol e/ou utilização de
fontes alternativas de carbono para o processo fermentativo. Neste trabalho,
linhagens industriais de S. cerevisiae previamente selecionadas pela capacidade
de permanência no processo industrial foram utilizadas como hospedeiras em
experimentos de manipulação genética com intuito de modificar o metabolismo
redox de forma a aumentar o rendimento a etanol. Entretanto, a constituição
genética das linhagens industriais requereu que uma série de adaptações aos
procedimentos convencionais de manipulação genética em linhagens de
laboratório fossem otimizadas. O primeiro tipo de atividade consistiu no desenho
experimental e no aprimoramento dos procedimentos de deleção gênica baseados
na recombinação de seqüências homólogas em cassetes de integração. Para este
fim, o gene GDH1, codificador da enzima glutamato desidrogenase, foi parcial ou
completamente removido do genoma da linhagem industrial com o uso de
fragmentos de PCR que continham seqüências com mais de 300 bp de homologia
com as regiões 5 e 3´ do gene alvo. Este gene codifica a principal enzima da via
de assimilação de amônia e sua remoção deve causar a substituição dos
cofatores NADPH por NADH nesta via. Tanto a extensão das seqüências de
homologia quanto os tipos de primers de verificação da integração e da deleção
foram otimizados. A segunda estratégia consistiu na inserção genômica por
integração homóloga do gene bacteriano GAPN codificador da enzima
gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase. Ao contrário da enzima da levedura, esta
enzima bacteriana utiliza NADPH como cofator, ao invés de NADH, e não
promove a síntese de ATP. O gene bacteriano foi clonado em um plasmídeo que
apresenta seqüências das regiões 5 e 3 do gene HO de S. cerevisiae e o cassete
de integração foi utilizado para inserção no lócus HO do genoma da levedura.
Para esta atividade, os tipos de primers de verificação da integração também
foram otimizados. O conjunto de procedimentos experimentais descritos neste
trabalho abre oportunidades para futuras manipulações genéticas que possam
produzir células recombinantes úteis para os processos industriais. Além disso,
faz-se necessária a construção de vetores de integração que permitam a posterior
remoção da marcas de resistência a antibióticos, mantendo-se a capacidade de
adaptação aos ambientes industriais
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/1916 |
| Date | January 2006 |
| Creators | GUEIROS, Rute Salgues |
| Contributors | MORAIS JÚNIOR, Marcos Antônio de |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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