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Previous issue date: 2017-02-22 / CAPES / Streptomyces é produtor de diversos metabólitos secundários, incluindo L-asparaginase, uma enzima que hidrolisa a asparagina em ácido aspártico e amônia. Logo, tem sido utilizada como agente quimioterápico no tratamento da leucemia linfoblástica aguda, pois estas células não produzem asparagina e dependem do aminoácido livre para a síntese proteica. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade citotóxica, genotóxica e imunomodulatória da L-asparaginase produzida por Streptomyces ansochromogenes UFPEDA-3420. A enzima foi produzida a partir da determinação dos parâmetros ideais de cultivo do micro-organismo. Sua atividade foi determinada pela dosagem de amônia liberada por Nesslerização. O extrato bruto foi purificado por métodos cromatográficos. O peso molecular foi determinado por eletroforese SDS-PAGE. O efeito citotóxico da L-asparaginase foi observado frente às linhagens de células tumorais: HEp-2 (carcinoma de laringe), NCIH-292 (carcinoma mucoepidermoide de pulmão), MOLT-4 (Leucemia linfoblástica humana), K562 (leucemia mielóide), HL-60 (leucemia aguda promielocítica) e MCF-7 (adenocarcinoma de mama), utilizando o ensaio do MTT. Os efeitos genotóxicos foram determinados pelos Testes Cometa Alcalino e de Micronúcleo nas linhagens tumorais NCIH-292, MCF-7 e MOLT-4 e em células normais PBMC (Células Mononucleadas de Sangue Periférico), utilizando as concentrações 12,5, 25 e 50 μg/mL de L-asparaginase, como controle positivo a Doxorrubicina na concentração da sua IC₅₀ para cada célula tumoral: 0,5 μg/mL (NICH-292), 0,04 μg/mL (MOLT-4) e 0,2 μg/mL (MCF-7) e como controle negativo as células sem tratamento. Os parâmetros ideais de cultivo foram fermentação em meio M9, 48 horas, pH=6, 37ºC e rendimento máximo de 743.29 UI/mL. A enzima foi purificada até homogeneidade com fator de purificação 6,06, rendimento 27,68% da atividade inicial e atividade específica final 35.205,76 UI/mg. A enzima purificada apresentou peso molecular de 63,99 kDa, com atividade catalítica ótima em pH=7 e 40ºC. L-asparaginase apresentou valores de Km de 3,224 mM e Vmax de 161,29 UI/min. Quanto aos efeitos citotóxicos, apresentou IC₅₀ de 25 μg/mL frente à linhagem MOLT-4. Foi observado que esta substância possui efeitos genotóxicos sobre as linhagens estudadas. No parâmetro Índice de Danos, as três linhagens tumorais apresentaram resultados significativos para todas as concentrações testadas quando comparadas com células não tratadas, exceto na concentração de 12,5 μg/mL na linhagem MOLT-4. No Teste do micronúcleo, foi observado que em todas as células houve indução à formação de micronúcleos, coferindo efeito genotóxico a enzima. Isso demonstra que nas linhagens MOLT-4 e PBMC, tanto o parâmetro células micronucleadas quanto a frequência de micronúcleos aumentaram de acordo com o aumento da concentração de L-asparaginase, demonstrando um efeito dose/resposta positivo. L-asparaginase induziu a ativação e proliferação de linfócitos TCD8+ e produziu níveis elevados de TNF-α, IFN-γ, IL-2 e IL-10 em 24 horas. O presente estudo possui grande relevância científica, pois consiste no primeiro relato de produção de L-asparaginase por Streptomyces ansochomogenes UFPEDA-3420, sua ação genotóxica em células tumorais e normais e atividade imunomodulatória, de forma inédita. Esse fato é importante, pois L-asparaginase tem sido empregada nas terapias convencionais de controle e tratamento do câncer. Dessa forma, esta enzima configura-se como molécula promissora para utilização em modelos in vivo e para aprofundar testes pré-clínicos. / Streptomyces is a producer of several secondary metabolites, including L-asparaginase, an enzyme that hydrolyzes asparagine in aspartic acid and ammonia. Therefore, it has been used as chemotherapeutic agent in the treatment of acute lymphoblastic leukemia, since these cells doesn’t produce asparagine and depend on free amino acid for protein synthesis. The objective of this study was to evaluate the cytotoxic, genotoxic and immunomodulatory activity of L-asparaginase produced by Streptomyces ansochromogenes UFPEDA-3420. The enzyme was produced from the determination of the ideal microorganism culture parameters. Its activity was determined by the dosage of ammonia released by Nesslerization. The crude extract was purified by chromatographic methods. The molecular weight was determined by SDS-PAGE electrophoresis. The cytotoxic effect of L-asparaginase was observed against tumor cell lines: HEp-2 (laryngeal carcinoma), NCIH-292 (mucoepidermoid carcinoma of the lung), MOLT-4 (human lymphoblastic leukemia), K562(myeloid leukemia), HL-60 (promyelocytic acute leukemia) and MCF-7 (breast adenocarcinoma) using the MTT assay. The genotoxic effects were determined by Alkaline Comet and Micronucleus Tests in NCIH-292, MCF-7 and MOLT-4 tumor cell lines and in PBMC (Mononuclear Peripheral Blood Cells), using the concentrations 12.5, 25 and 50 μg/mL of L-asparaginase, as a positive control to Doxorubicin at the concentration of its IC50 for each tumor cell: 0.5 μg/mL (NICH-292), 0.04 μg/mL (MOLT-4) and 0.2 μg/mL (MCF-7) and as a negative control the cells without treatment. The ideal culture parameters were fermentation in M9 medium, 48 hours, pH=6.37 and maximum yield of 743.29 IU/mL. The enzyme was purified to homogeneity with purification factor 6.06, yield 27.68% of the initial activity and final specific activity 35,205.76 IU/mg. The purified enzyme had a molecular weight of 63.99 kDa, with optimum catalytic activity at pH=7 and 40ºC. L-asparaginase had values of Km of 3.224 mM and Vmax of 161.29 IU/min. Regarding the cytotoxic effects, IC50 of 25 μg/mL was presented in relation to the MOLT-4 lineage. It was observed that this substance has genotoxic effects on the studied strains. In the parameter Damage Index, the three tumor lines presented significant results for all the concentrations tested when compared to untreated cells, except in the concentration of 12.5 μg/mL in the MOLT-4 lineage. In the Micronucleus test, was observed that in all the cells there was induction to the formation of micronuclei, cofering genotoxic effect to the enzyme. This demonstrates that in the MOLT-4 and PBMC lines, both the micronucleate parameters and micronucleus frequency increased as the L-asparaginase concentration increased, demonstrating a positive dose/response effect. L-asparaginase induced the activation and proliferation of TCD8+ lymphocytes and produced elevated levels of TNF-α, IFN-γ, IL-2 and IL-10, in 24 hours. The present study has great scientific relevance, since it consists of the first report of production of L-asparaginase by Streptomyces ansochomogenes UFPEDA-3420, its genotoxic action in normal and tumor cells and immunomodulatory activity, in an unprecedented way. This fact is important because L-asparaginase has been used in conventional cancer treatment and control therapies. Thus, this enzyme is configured as a promising molecule for use in vivo models and to deepen preclinical tests.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/25331 |
| Date | 22 February 2017 |
| Creators | LACERDA, Glêzia Renata da Silva |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/2747085702096375, NASCIMENTO, Silene Carneiro do, LIMA, Gláucia Manoella de Souza |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Ciencias Biologicas, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/embargoedAccess |
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