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Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sabe-se que algumas árvores, como a aroeira-do-sertão, Myracrodruon urundeuva,
apresentam madeira que não é atacada por agentes biodeterioradores. O
conhecimento da resistência natural da madeira é importante na recomendação de
sua utilização, para evitar gastos com a reposição de peças deterioradas e reduzir
os impactos sobre as florestas remanescentes. Os extrativos de madeiras são
conhecidos por aumentar a durabilidade e sugere-se que compostos com atividades
antioxidante, antimicrobiana e inseticida também protegem o cerne. Dentre os
componentes do metabolismo primário das plantas, algumas proteínas têm sido
relacionadas a mecanismos de defesa, como as lectinas, proteínas que se ligam a
carboidratos. Os objetivos desse trabalho foram (A) analisar fitoquimicamente e
avaliar a propriedade antioxidante de preparações do cerne de M. urundeuva e (B)
isolar, caracterizar parcialmente e avaliar potencial biotecnológico e atividades
biológicas de uma lectina isolada do cerne. Pó do cerne de M. urundeuva foi
utilizado na preparação dos extratos metanólico (EM) e salino NaCl 0,15 M (ES;
10%, p/v). Os extratos foram avaliados quanto à presença de extrativos e
metabólitos secundários e quanto à capacidade de capturar radicais livres (atividade
antioxidante). A presença de lectinas em ES foi detectada através do ensaio de
atividade hemaglutinante (AH). As proteínas presentes em ES foram precipitadas
com sulfato de amônio. A fração 40-60% (F1), de maior AH específica (AHE), foi
avaliada quanto à presença de metabólitos secundários e atividade antioxidante. AH
de F1 foi avaliada em presença de carboidratos e glicoproteínas. F1 foi aplicada em
coluna de quitina (polímero de N-acetil-glicosamina, GlcNAc) equilibrada com NaCl
0,15M. O pico protéico ativo eluído com ácido acético 1,0 M foi definido como a
lectina de cerne de M. urundeuva (MuHL). A afinidade da lectina por GlcNAc foi
também avaliada através da eluição da coluna de quitina com solução de GlcNAc
0,1 M e por cromatografia de F1 em coluna desse monossacarídeo imobilizado em
agarose. A massa molecular nativa de MuHL foi obtida através de cromatografia de
exclusão molecular em coluna Hiprep 16/60 Sephacryl S-300/Äkta-FPLC. MuHL foi
analisada em eletroforese em gel de poliacrilamida para proteínas nativas básicas ou
ácidas e em condições desnaturantes e redutoras (SDS-PAGE). MuHL também foi
avaliada quanto à natureza glicoprotéica. A AH de MuHL em presença de íons, a
estabilidade térmica da lectina e o efeito do pH sobre a AH foram avaliados. MuHL
foi imobilizada em Sepharose CL-4B, para ser utilizada no isolamento de
glicoproteínas, e conjugada à peroxidase para utilização como marcador
histoquímico de tecidos de próstata (normal, hiperplasia benigna e carcinoma) e do
hipocampo de pacientes com Mal de Alzheimer. Atividade antibacteriana de MuHL
foi avaliada frente a bactérias Gram-positivas (Bacillus subtilis, Corynebacterium
callunae, Staphylococcus aureus e Streptococcus faecalis) e Gram-negativas
(Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa). As
concentrações mínimas inibitória (CMI), bactericida (CMB) e aglutinante (CMA)
foram determinadas. Atividade antifúngica contra Fusarium (F. solani, F. oxysporum,
F. moniliforme, F. decemcellulare, F. lateritium, F. fusarioides e F. verticiloides) e
atividades inseticida e repelente contra cupins Nasutitermes corniger de MuHL foram
avaliadas. A concentração que mata 50% dos insetos (CL50) foi determinada. MuHL
também foi avaliada quanto à atividade larvicida contra larvas no quarto estágio (L4)
de Aedes aegypti e as CL16, CL50 e CL84 foram calculadas. ES e EM apresentaram
flavonóides, proantocianidinas condensadas e leucoantocianidinas. Ação
antioxidante de EM e ES foi evidenciada pela capacidade dos extratos de captar
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radicais livres DPPH. A quantidade de radicais que reagiu com EM e ES foi bastante
elevada (91,1% e 84,5,%, respectivamente), enquanto que com F1 foi muito baixa
(11,2%). ES, F1 e MuHL aglutinaram eritrócitos de todos os tipos sangüíneos do
sistema ABO, assim como eritrócitos de coelho. A AH de F1 foi inibida parcialmente
por GlcNAc (estimulando a purificação da lectina por cromatografia de afinidade em
coluna de quitina) e pelas glicoproteínas fetuína, ovoalbumina, tiroglobulina e
azocazeína. A avaliação fitoquímica de F1 demonstrou somente resquícios de
leucoantocianidinas. MuHL, recuperada da cromatografia em coluna de quitina com
AHE de 2.560, foi inibida por N-acetil-glicosamina. Eluição com solução de GlcNAc
também resultou em recuperação da AH e a lectina também adsorveu à matriz
Agarose-GlcNAc. MuHL se apresentou como uma glicoproteína básica constituída
de um único polipeptídeo de aproximadamente 14,4 kDa (em SDS-PAGE). O perfil
cromatográfico de MuHL na cromatografia de exclusão molecular revelou um pico
principal de 21 kDa. Ensaios indicaram que a lectina é termoresistente (30-100 ºC) e
sensível à variação de pH, apresentando maior AH em pH 5,5. A AH de MuHL, após
diálise contra o agente quelante EDTA, foi estimulada por Ca+2, Mg+2 e Mn+2. A
matriz MuHL-Sepharose foi capaz de reter as glicoproteínas comerciais fetuína,
tireoglobulina e ovoalbumina, assim como glicoproteínas presentes no homogenato
da tireóide de porco, soro fetal bovino e extrato da clara de ovo. MuHL marcou de
forma intensa e homogênea a membrana das células de tecidos de hiperplasia
benigna prostática e hipocampo de pacientes com o Mal de Alzheimer. A inibição por
GlcNAc e a capacidade de se ligar à quitina estimularam a avaliação das
propriedades antimicrobiana e inseticida da lectina. MuHL apresentou atividade
antifúngica após 72 horas contra todas as espécies de Fusarium. ES, F1 e MuHL
apresentaram efeito antibacteriano sobre todas as bactérias testadas. A maior ação
inibitória de MuHL foi para S. aureus (CMI: 0,58 μg/mL; CMB: 8,1 μg/mL). MuHL
também aglutinou todas as bactérias, sendo S. aureus a espécie mais sensível
(CMA: 2.34 μg/mL). O contato com MuHL em todas as concentrações testadas
induziu 100% de mortalidade dos operários e soldados. Os valores de CL50 após 4
dias foram de 0,248 mg/mL para os operários e 0,199 mg/mL para os soldados.
MuHL não apresentou efeito repelente. A lectina também apresentou atividade
larvicida sobre A. aegypti. Os valores de CL16, CL50 e CL84 foram de 0,03, 0,04 e
0,05 mg/ml. O estudo revelou a presença de compostos com potente atividade
antioxidante e contribuiu para a construção de um painel sobre lectinas de plantas
ao caracterizar a lectina isolada. A lectina de M. urundeuva é o primeiro peptídio
bioativo encontrado em um cerne e em um tecido de uma madeira-de-lei. Por suas
propriedades antimicrobiana e inseticida, MuHL é, provavelmente, um dos
componentes da barreira química que confere a elevada resistência da madeira da
aroeira-do-sertão à biodegradação. MuHL também é a primeira lectina com atividade
inseticida descrita para cupins e A. aegypti. Em resumo, o trabalho ressalta a
importância do estudo das propriedades dessa planta, ameaçada de extinção, tanto
para o entendimento da fisiologia das plantas resistentes quanto como uma
potencial fonte de lectina que pode ser explorada do ponto de vista biotecnológico
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/9263 |
| Date | 31 January 2008 |
| Creators | SÁ, Roberto Araújo |
| Contributors | BIEBER, Lothar Wilhelm |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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