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Previous issue date: 2011-07-18 / Several recombinant proteins have been studied as immunocontraception agents in
mammals, among them the Gonadotropin-releasing hormone (GnRH). Nevertheless,
due to its low molecular weight, GnRH needs to be conjugated with a carrier protein.
Among the eukaryotic platforms the yeast Pichia pastoris, which are able of
promoting post-translational modifications to expressed recombinant protein. The aim
of this study was to clone and express the GnRH/LTB chimera in P. pastoris, and to
test it as an immunocontraceptive. In order to accomplish this, sequences of P.
pastoris codons usage were synthesized and cloned into the plasmid pPICZαB. The
plasmid containing the sequence were propagated and transformed into yeast by
electroporation. The transformed colonies were selected by resistance to antibiotics
and confirmed by Colony Blotting. The selected clone was cultivated, induced and
the protein expressed in supernatant. The protein was concentrated and used as a
vaccine antigen. BALB/c males mice were vaccinated twice 15 apart with 100µg de
LTB/GnRH adjuvanted with aluminum hydroxide. The immune response was
evaluated by ELISA, showing seraconversion in vaccinated animals. The sperm
concentration in the control group was 16.93 x 107 and 8.00 x 107 sperm/mL in the
immunized group. Vaccination caused a reduction of spermatogenesis (p < 0,05),
vacuolization and disorganization of the seminiferous tubules. We concluded that the
yeast was able to express the recombinant protein LTB/GnRH, and it demonstrated
immunocontraceptive potential in mice. / Diversas proteínas recombinantes estão sendo pesquisadas para utilização na
imunocontracepção de mamíferos. Entre elas, o hormônio liberador de
gonadotrofinas (GnRH), entretanto devido ao seu baixo peso molecular há
necessidade de associá-lo a uma molécula carreadora. Dentre as plataformas
eucarióticas, encontra-se a levedura Pichia pastoris que tem possibilitado expressão
e modificações pós-traducionais das proteínas recombinantes. O objetivo deste
trabalho foi clonar e expressar a quimera LTB/GnRH em P. pastoris, visando sua
utilização como imunocontraceptivo. Para tanto, sequências com os códons
preferenciais de P. pastoris da proteína foram sintetizadas e clonada no plasmídeo
pPICZαB. O plasmídeo foi propagado e transformado na levedura por eletroporação.
As colônias transformadas foram selecionadas por resistência antibiótica e
confirmadas por Colony Blotting. O clone selecionado foi cultivado e após indução
expressou a proteína no sobrenadante. A proteína foi concentrada e utilizada como
antígeno vacinal. Camundongos BALB/c machos foram vacinados com duas doses
de 100µg de LTB/GnRH adsorvidas em hidróxido de alumínio com intervalo de 15
dias. A resposta imune foi avaliada por ELISA, mostrando soroconversão nos
animais imunizados. A concentração espermática no grupo controle foi 16,93 x 107 e
no grupo imunizado 8,00 x 107 espermatozóides/mL. A imunização induziu a
redução da espermatogênese (p < 0,05), vacuolização nos túbulos seminíferos e
desorganização testicular. Concluiu-se que a levedura foi capaz de expressar a
proteína LTB/GnRH recombinante e a mesma apresentou potencial
imunocontraceptivo em camundongos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpel.edu.br:123456789/1296 |
| Date | 18 July 2011 |
| Creators | Pereira, Juliano Lacava |
| Contributors | CPF:20732660025, http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763076J5, Leite, Fabio Pereira Leivas |
| Publisher | Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFPel, BR, Biotecnologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPEL, instname:Universidade Federal de Pelotas, instacron:UFPEL |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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