Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-23T08:29:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Em Saccharomyces cerevisiae, a permease codificada pelo gene AGT1 é responsável pelo transporte ativo de uma série de a-glicosídeos usados em diversas aplicações industriais de leveduras, como panificação, cervejaria, produção de bebidas destiladas e álcool combustível. O transporte destes açúcares para dentro da célula, através de proteínas transportadoras, é o passo inicial para seu metabolismo, e também constitui um fator limitante na fermentação do açúcar. Com o intuito de compreender detalhes moleculares do mecanismo de transporte e contribuir para a otimização do processo fermentativo, no presente trabalho foi analisado os resíduos de aminoácidos da permease Agt1p que poderiam estar envolvidos na ligação do próton e/ou especificidade do substrato. Analisando a estrutura prevista para o transportador Agt1p, identificamos 4 resíduos de aminoácidos carregados em seus segmentos transmembrana (Glu-120, Asp-123, Glu-167 e Arg-504), resíduos que estão significativamente conservados nas mesmas posições em outros genes de transportadores de a-glicosídeos em Saccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces e Candida. Permeases Agt1p mutantes nos resíduos Glu-120, Asp-123 e Arg-504 foram geradas por mutagênese sítio-dirigida, expressadas em uma cepa agt1?, e a funcionalidade das permeases foi testada através do crescimento em maltotriose. A substituição do resíduo Arg-504 pela alanina aboliu completamente a utilização de maltotriose pelas células, enquanto que as permeases mutantes geradas pela substituição do Asp-123 pela glicina ou do Glu-120 pela alanina ocasionaram menores taxas de consumo de maltotriose e menor rendimento de etanol quando comparado ao transportador Agt1p normal, porém não impediram o crescimento em maltotriose. A atividade de transporte da permease Agt1p normal ou dos mutantes derivados também foi avaliada pelo transporte de pNPaG (substrato específico para o transportador Agt1p) e pelo transporte ativo de outros a-glicosídeos (maltose, maltotriose, trealose, sacarose e a-metil glicosídeo). Nesses ensaios, a mutação R504A ocasionou a maior perda na atividade de transporte da permease, tendo em vista que apresentou taxas similares às células sem a permease Agt1p. Em contrapartida, os mutantes E120A e D123G apresentaram atividades de transporte de pNPaG e de co-transporte açúcar-H+ inferiores à observada para o transportador Agt1p normal, condizendo com o perfil de utilização de maltotriose. Apesar das diferentes atividades de transporte encontradas para as permeases construídas, todas essas permeases (normal ou mutantes) quando fusionadas à GFP em sua extremidade C-terminal apresentaram-se normalmente localizadas na membrana plasmática. Portanto, os resultados demonstram o envolvimento dos resíduos mutados no transporte ativo de açúcares realizado pela permease Agt1p, sugerindo a participação dos resíduos Glu-120 e Asp-123 na translocação do próton, e de Arg-504 na ligação do substrato. Porém, estudos ainda são necessários para melhor esclarecer o mecanismo de transporte ativo realizado pela permease Agt1p, o que certamente é de grande relevância para o desenvolvimento de estratégias que permitam a otimização dos processos fermentativos industriais.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsc.br:123456789/90315 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Trichez, Debora |
| Contributors | Universidade Federal de Santa Catarina, Stambuk, Boris Juan Carlos Ugarte, Terenzi, Hermán |
| Publisher | Florianópolis, SC |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | iv, 79 f.| il., grafs., tabs. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSC, instname:Universidade Federal de Santa Catarina, instacron:UFSC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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