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Previous issue date: 2011-09-21 / Universidade Federal de Sao Carlos / This study addresses the production, isolation and identification of the substance present in culture broth of Streptomyces carpaticus which showed high biological activity against human tumor cell lines HL-60 (promyelocytic leukemia), MDA-MB 435 (breast carcinoma ), HCT-8 (colon carcinoma), SF-295 (glioblastoma). Cultures of Streptomyces carpaticus in culture medium DSMZ 65 were performed in shake flasks. Initial bioassays of the culture broth extracts showed antiproliferative activity close to 100% inhibition against the tumor cell lines. In order to obtain greater volume of culture medium to isolate the compound of interest, bioreactor cultivations were performed in bioreactor with 12 L working volume. After microfiltration and ultrafiltration of the culture broth through a 0.22- micron and 3 kDa membrane filter, the retentate was then subjected to partitioning using different organic solvents (ethyl acetate and n-buthanol). The fractionation of the extracts was bioguided based on the bioassay results and on HPLC-DAD-MS analysis. The fractionations led to the isolation and identification of the cyclodepsipeptide Valinomycin as responsible for cytotoxic activity. In addition, the results showed the strain as isopalmitic acid producer. Values of inhibition concentration (IC50) obtained for the compound isolated from the broth, against various tumor cell lines, presented low values ranging between 2 and 10 ng.mL-1. The use of bench scale bioreactor, bioguided fractionation and mass spectrometry proved to be fundamental to the development of this study, because it was evidenced that the discovered compound responsible for the antiproliferative activity is produced at very low concentrations. The use of HPLC-DADMS/ MS by selective ion monitoring was able to propose a methodology to estimate Valinomycin production in four different culture media tested, an important result for future studies regarding the development of the production and purification process of Valinomycin by S. carpaticus. / A presente tese teve como objetivo principal produzir, isolar e identificar substância presente em caldo de cultivo de Streptomyces carpaticus que apresentou alta atividade biológica contra as linhagens de células tumorais HL-60 (Leucemia promielocítica humana), MDA-MB 435 (Carcinoma de mama humano), HCT-8 (Carcinoma de cólon humano), SF-295 (Glioblastoma humano). Inicialmente foram realizados cultivos de Streptomyces carpaticus em mesa incubadora rotativa em meio de cultura DSMZ 65. Ensaios iniciais de extratos do caldo de cultivo apresentaram atividade antiproliferativa próximas de 100% de inibição frente às linhagens de células tumorais. Com o propósito de se obter maior volume de caldo de cultivo para isolamento do composto de interesse, foram realizados cultivos em biorreator de bancada com 12 L de volume útil. Ao final do cultivo o caldo foi microfiltrado e ultrafiltrado em membranas de 0,22 μm e 3 kDa, o retido foi submetido a partições utilizando diferentes solventes orgânicos (acetato de etila e n-butanol). Os fracionamentos dos extratos foram bioguiados com base nos resultados dos bioensaios e de análises por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (HPLCDAD- MS). Os fracionamentos conduziram ao isolamento e identificação do ciclododecadepsipeptídeo Valinomicina como responsável pela atividade citotóxica, além de evidenciar a linhagem como produtora de ácido isopalmítico. Valores de concentração de inibição (IC50) obtidos para o composto isolado do caldo, frente às diferentes linhagens de células tumorais apresentaram baixas concentrações entre 2 e 10 ng.mL-1. O uso de biorreatores de bancada, o fracionamento bioguiado e o uso da técnica de espectrometria de massas se revelaram de fundamental importância para o desenvolvimento da pesquisa uma vez que, após descoberto o correspondente composto responsável pela atividade antiproliferativa relatada, foi evidenciado que este é produzido em concentrações muito baixas pela linhagem estudada. A utilização de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas por monitoramento seletivo de íons permitiu a obtenção de uma metodologia de estimativa de produção em quatro diferentes meios de cultura testados, resultado de grande importância para estudos futuros no que se refere ao desenvolvimento do processo de produção e purificação do composto Valinomicina por S. carpaticus.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/3916 |
| Date | 21 September 2011 |
| Creators | Ferreira, Douglas |
| Contributors | Badino Júnior, Alberto Colli |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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