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Previous issue date: 2007-03-09 / Financiadora de Estudos e Projetos / Due to the great economic importance of sugarcane crop in Brazil, the occurrence of
infections by phytopathogens leading to decreased productivity and quality remains a serious
problem. As the plants have natural mechanisms of defense against the attack of fungi
and insects, amongst which the inhibitors of proteases are distinguished, the use of these
substances in the development of resistant plants or in pesticide production may be an interesting
alternative. One of the major classes of protease inhibitors acting against the attack
of pathogens is the cystatins, proteins that inhibit cysteine proteases specifically. Canecystatin
was the first cysteine protease inhibitor characterized from sugarcane. This gene
codes for a ~ 14 kDa protein that contains conserved regions common to the cystatin family.
Although the protein has previously been produced in a bacterial system of expression,
in this work we use this sugarcane cystatin as a model for the implementation of a heterologous
protein expression system in insect cells. This system has some advantages relatively
to the prokaryotic system such as the possibility of posttranslational modifications.
The recombinant protein was expressed in this system in a soluble form and purified using
affinity chromatography in a nickel column, rendering approximately 23 mg/L of pure protein.
The activity of the protein was assayed against papain, being capable of inhibiting the
activity of this cysteine protease efficiently. Furthermore, the stability of the protein was
analyzed in different conditions of pH and temperature. We conclude that the canecystatin
is a good model for the implementation of the Baculovirus Expression System at the Molecular
Biology Laboratory of the UFSCar / Devido à grande importância da cultura da cana-de-açúcar no Brasil, a ocorrência de
infecções por fitopatógenos constitui um grave problema que acarreta queda na produtividade
e na qualidade da lavoura canavieira. Uma vez que as plantas têm mecanismos naturais
de defesa contra o ataque de fungos e insetos, dentre os quais se destacam os inibidores
de proteases, a utilização dessas substâncias no desenvolvimento de plantas resistentes
ou na produção de pesticidas seria uma alternativa interessante. Um tipo de inibidor de
protease que atua na proteção contra o ataque de patógenos e como proteínas de reservas
em algumas sementes são as cistatinas, proteínas que inibem especificamente cisteínoproteases.
A Canacistatina foi o primeiro inibidor de cisteíno-protease caracterizado originado
da cana-de-açúcar. Apesar de já ter sido anteriormente produzida em sistema bacteriano
de expressão, a Canacistatina foi utilizada, nesse trabalho, como modelo de estudo
para implementação do sistema de expressão de proteínas heterólogas em células de inseto.
Esse sistema apresenta algumas vantagens sobre o sistema procariótico como a possibilidade de realizarem modificações pós-traducionais. A proteína recombinante foi expressa
nesse sistema na forma solúvel e purificada em cromatografia de afinidade em coluna de
níquel, resultando em um rendimento de 23 gramas por litro de cultura. A proteína purificada
foi submetida a testes de inibição enzimática contra a papaína, sendo capaz de inibir
satisfatoriamente a atividade dessa cisteíno-protease. Também foram realizados testes de
estabilidade desse inibidor em diferentes condições de pH e temperatura, mostrando-se
estável. A Canacistatina foi um modelo de estudo adequado para a implementação do sistema
de expressão de proteínas no Laboratório de Biologia Molecular da UFSCar
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/5439 |
| Date | 09 March 2007 |
| Creators | Silva, Mylene de Melo |
| Contributors | Silva, Flávio Henrique da |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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