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Previous issue date: 2005-02-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / Disintegrins are snake venom proteins used in the study of integrin-mediated cellular
adhesion through integrins. Recombinant disintegrin production may notable supply faster,
larger and most homogeneous protein samples than bruit venom processing. This work
describes optimization of the recombinant ACLD-C expression technique. ACLD-C is a
disintegrin-like protein from Agkistrodon contortrix laticinctus, that have a disintegrin-like
domain with DCD motif, and a cysteine-rich domain. This protein was subcloned from the
ACLD clone (GenBank U86634), a metallopeptidase. A protocol of expression was
established in our laboratory, where recombinant ACLD-C is produced in E. coli, using the
expression vector pMal-p. This allows protein target expression in form of N-terminal fusion
with MBP (maltose-binding protein), that facilitate purification, correct folding and
production of disintegrin in soluble form. In fact, MBP/ACLD-C was was expressed in
soluble form and purified in two stages: affinity comatography in amilose resin and
cromatography of gel-filtration in superdex-200 resin. Modifications in expression protocol
optimized MBP/ACLD-C expression in culture of 0,4 mg/L of culture of 1,2 mg/L (12,6%
total of protein in periplasmic space of E.coli). MBP/ACLD-C imobilizated in amilose resin
was subjected to digestion with enzyme factor Xa to separate ACLD-C of MBP. The
separation was confirmed through positive reaction with anti-ALT-C antibody. ALT-C is a
disintegrin-like protein from Bothrops alternatus. ALT-C induced both expression of VEGF
in human fibroblasts and proliferation of endothelial cells and angiogenesis. In second part of
this work, we investigated if MBP/ACLD-C was also able to induce the expression of this
growth factor in this cells. MBP/ACLD-C and two other disintegrins, echistatina, a
disintegrin-RGD, and EC6, a heterodimeric disintegrin, were incubated with fibroblasts. The
influency of these proteins in VEGF expression was evaluated by ELISA. MBP/ACLD-C was
able to strongly induce the expression of VEGF until 4 hours, when the level decreased until
24 hours. Experiment in period of 24 48 hours was not done due to problems of
contaminations. Echistatin did not induced VEGF expression, but induced fibroblasts
dettachment from plastic. The latter event was not observed in MBP/ACLD-C or EC6
incubated cells. / As desintegrinas são proteínas de veneno de serpente usadas no estudo de processos
biológicos envolvendo a adesão celular mediada por integrinas. A produção de desintegrinas
recombinantes é de grande importância para tais estudos, pois podem ser obtidas de forma
mais rápida, com maior rendimento e qualidade mais constante quando comparada com a
obtenção a partir de veneno bruto. Esta dissertação descreve a otimização da expressão da
ACLD-C recombinante. ACLD-C é uma proteína tipo desintegrina da serpente Agkistrodon
contortrix laticinctus, que possui um domínio desintegrina-like com um motivo DCD e um
domínio rico em cisteína. Esta proteína foi subclonada a partir do clone da ACLD (GenBank
U86634), uma metalopeptidase. Um protocolo de expressão foi estabelecido em nosso
laboratório, onde ACLD-C recombinante é produzida em E. coli, utilizando-se o vetor de
expressão pMal-p. Este vetor possibilita a expressão da proteína-alvo na forma de fusão Nterminal
com a proteína MBP (maltose-binding protein), a qual facilita a purificação, o
enovelamento correto e a produção da desintegrina na forma solúvel. De fato, MBP/ACLD-C
foi expressa na forma solúvel e purificada em duas etapas: cromatografia de afinidade em
resina de amilose e cromatografia de gel-filtração em resina superdex-200. Modificações no
protocolo de expressão permitiram a otimização da expressão da MBP/ACLD-C de 0,4mg/L
de cultura para 1,2mg/L de cultura O rendimento final da MBP/ACLD-C foi de 1,2mg/L de
cultura (12,6% do total de proteínas no espaço periplásmico de E. coli). MBP/ACLD-C
imobilizada em resina de amilose foi submetida à reação de clivagem com a enzima fator Xa
para separar ACLD-C da MBP. A separação foi confirmada através da reação positiva ao
anticorpo anti-ALT-C, uma desintegrina-like de Bothrops alternatus. Estudos com ALT-C
mostraram que ela foi capaz de induzir a expressão de VEGF (vascular endothelial growth
factor) em fibroblastos humanos e induzir a proliferação de células endoteliais e a
angiogênese. Assim, resolveu-se investigar se MBP/ACLD-C também é capaz de induzir a
expressão deste fator de crescimento nestas células, o que constitui a segunda parte deste
trabalho. MBP/ACLD-C e outras duas desintegrinas, echistatina, uma desintegrina-RGD, e
EC6, uma desintegrina heterodimérica, foram incubadas com os fibroblastos para verificar a
influência dessas proteínas na expressão de VEGF através de ensaios de ELISA.
MBP/ACLD-C foi capaz de induzir fortemente a expressão de VEGF até 4h, quando o nível
da citocina decresceu até 24 e novamente aumentou até 48h. EC6 também foi capaz de
induzir a expressão do fator de crescimento até 4h, quando o nível também decresceu até 24h.
O experimento no período de 24h-48h não foi realizado devido a problemas de contaminação.
Echistatina, por sua vez, não apresentou indução de VEGF em relação ao controle, e as
células incubadas com essa desintegrina desaderiram do plástico, o que não ocorreu com as
outras duas proteínas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/5534 |
| Date | 17 February 2005 |
| Creators | Ribeiro, Juliana Uema |
| Contributors | Araújo, Heloísa Sobreiro Selistre de |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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