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Previous issue date: 2010-07-30 / Financiadora de Estudos e Projetos / Because the close relationship between men and dogs, possibly some ectoparasites of dogs can be observed parasitizing man. The tick Rhipicecephalus sanguineus is an ectoparasite that has the ability to carry and transmit pathogens to humans. This arthropod, that is blood-feeding, is the main biological vector of the bacteria Ehrlichia canis. Currently, the diagnosis of this disease ehrlichiasis is based on blood, biochemical and serological tests, although they are unreliable for diagnosing the disease, since their clinical and clinicopathological features are largely nonspecific. Tetracyclines are commonly used in the treatment of ehrlichiosis, but studies show that some dogs remain positive for E. canis after treatment or after the loss of spontaneous infection. The chronic ehrlichiosis, having high prognosis fails, can result in high mortality. Therefore, more sensitive and reliable tests may help in the selection of dog carrying the disease. The PCR (polymerase chain reaction) has been used successfully in the diagnosis of E. canis. However, this molecular technology requires expensive equipment and specialized personnel to handle, which limits its use in laboratories routines. A more sensitive, specific, and simple to detect the microorganism method is desirable. In this work we develop the technique for detection of the bacterium Ehrlichia canis using the LAMP (Loop- Mediated Isothermal Amplification), which proved being very effective. Specific sequences of the E. canis dsb gene (disulfide bond) were used as target for the tested techniques. Dsb gene was highly specific in order to detect E. canis, since it is divergent of phylogenetically similar bacteria. Performed molecular tests showed a disease incidence greater than that indicated by authors using traditional diagnostic techniques. In the public kennel, 80% of the samples were infected, while in private clinics and veterinary hospital 40% had the disease. The developed diagnostic technique using LAMP is more sensitive than PCR, highly specific and does not require the prior DNA extraction to amplification. In addition, the product of amplification can be seen with the naked eye. We conclude that the diagnosis by the LAMP method enables the specific and high sensitivity identification of infected animals with minimal laboratory settings. These factors make possible the use of this diagnostic methodology for veterinary clinics, laboratories and educational institutions. / Devido à estreita relação entre o homem e o cão, eventualmente alguns ectoparasitas de cães podem ser observados parasitando o homem. O carrapato Rhipicecephalus sanguineus é um ectoparasita que possui a capacidade de carregar e transmitir patógenos aos seres humanos. Esse artrópode, por exercer hematofagia, é o principal vetor biológico e reservatório da bactéria Ehrlichia canis. Atualmente, o diagnóstico da erliquiose é baseado em testes hematológicos, bioquímicos e sorológicos, embora sejam pouco confiáveis para diagnostica-lá, uma vez que suas características clínicas e clinicopatológicas são amplamente inespecíficas. As tetraciclinas são comumente utilizadas no tratamento da Erliquiose, mas estudos mostram que alguns cães permanecem soropositivos para E. canis após o tratamento ou após a perda da infecção espontânea. A Erliquiose crônica por ter falhas de prognóstico, pode resultar em alta mortalidade. Portanto, testes mais sensíveis e confiáveis poderão auxiliar na seleção de cães portadores. A PCR (reação em cadeia da polimerase) tem sido usada com sucesso no diagnóstico da bactéria E. canis. Entretanto, esta tecnologia molecular necessita de equipamentos caros e pessoal especializado para sua execução, o que limita o seu uso na rotina dos laboratórios. Assim uma metodologia mais sensível, específica, e simples de detectar o microorganismo é desejável. Neste trabalho desenvolvemos a detecção da bactéria Ehrlichia canis pena da técnica de LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), que se mostrou muito eficaz. Utilizamos sequências específicas do gene dsb (disulfide bond) de E. canis como alvo para as técnicas testadas. O gene dsb mostrou-se altamente específico para a detecção de E. canis, já que é divergente até mesmo das bactérias filogeneticamente próximas. Os testes moleculares realizados mostram uma incidência maior da doença do que aquela preconizada por autores que utilizam técnicas diagnósticas tradicionais. No canil municipal, 80% das amostras estavam infectadas; das clínicas particulares e do hospital veterinário 40% apresentaram a doença pela técnica de PCR. A técnica de diagnóstico por LAMP que foi desenvolvida é mais sensível do que o PCR, altamente específica e não é necessária a extração do DNA para a sua amplificação. Além disso, o produto da amplificação pode ser visualizado a olho nu. Concluímos que o diagnóstico pela metodologia LAMP possibilita a identificação específica e com alta sensibilidade de animais infectados, com mínima estrutura laboratorial. Tais fatores viabilizam a utilização dessa metodologia diagnóstica para clínicas veterinárias, laboratórios e instituições de ensino.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/6962 |
| Date | 30 July 2010 |
| Creators | Chiari, Maria Fernanda |
| Contributors | Moreira, Fernando Manuel Araújo |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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