Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-25T13:01:16Z
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2012_LuanaSalgadoQuilici.pdf: 11627198 bytes, checksum: db0d5e877103552a600a1f29f103e6b1 (MD5) / Visando a continuidade dos estudos referentes à modulação da expressão gênica em células de mamífero, no presente trabalho foram construídos promotores sintéticos contendo intron A completo (IAs) e deletado em 200 (?200s) e em 600 pb (?600s), dirigindo a expressão do gene repórter da luciferase e do anticorpo (Ab) recombinante, fragmento FvFc, anti-CD3 (pCO). O intron sintético teve sítios de restrição alterados a fim de facilitar processos de clonagem e promover a manutenção do sítio aceptor de splicing na construção ?600s. Estas construções foram transfectadas de forma transiente em células CHO-K1, e a expressão do Ab também foi analisada em população mista estável. Verificou-se que as construções sintéticas mostraram resultados similares para a expressão do gene repórter da luciferase, exceto para a construção ?600. Para esta construção específica, a versão sintética teve rearranjos de sítios de restrição que preservaram o sítio aceptor de splicing. Dessa forma, na comparação dos resultados de expressão das construções de luciferase com promotores contendo IA original e sintético, a atividade da luciferase na versão sintética teve aumento significativo de quase 4 vezes, levando à hipótese de que o splicing do IA está diretamente relacionado ao efeito de melhoramento da expressão do gene repórter. Ao analisar a expressão do Ab anti-CD3, ao contrário, não se observou o aumento esperado nas construções com intron, sendo a construção contendo o promotor sem intron a que apresentou maior detecção de Ab secretado. Testou-se também os níveis de expressão do mRNA do Ab anti-CD3 por qPCR, onde se verificou que, para as construções com intron, apesar da baixa detecção do Ab secretado, havia alta expressão do mRNA correspondente. Esse resultado indica que a grande quantidade de mRNA produzida pode não estar sendo devidamente processada e traduzida, levando à retenção da proteína na célula. Com isso, foi mostrado que o IA e suas deleções inovadoras podem melhorar a expressão gênica, sendo ferramentas importantes para a otimização da expressão de proteínas de interesse comercial em células de mamífero. _________________________________________________________________________________ ABSTARCT / In this study we have designed different synthetic promoters containing the full intron A (IAs), and the deletions of 200 (? 200s) and 600 bp (? 600s), directing the luciferase and recombinant anti-CD3 antibody (Ab) expression (pCO). These constructs were transiently transfected on CHO-K1 cells, and the Ab expression was analysed also by stable production on a mixed population. The synthetic constructs showed similar luciferase activity results compared to the wild-type construct, except by the ?600 construct. Regarding this specific construct, the synthetic version has restriction sites rearrangements to preserve the acceptor splicing site. Thus, comparing the luciferase expression among the wild-type and synthetic ?600 construct, the luciferase activity has increased significantly, leading to a hypothesis that the improvement of gene reporter expression is directly correlated to the IA splicing. On the contrary, when we analysed the anti-CD3 Ab expression, we did not observe the increment of protein expression, with the intronless construct being the more productive one. The anti-CD3 Ab mRNA levels were detected by qPCR. For the intron-containing constructs, despite the low levels of secreted Ab, there was high expression of corresponding mRNA. This result indicates that the great amount of mRNA produced was not correctly processed and translated, leading to protein retention inside the cell. Overall, we demonstrated that the IA and its innovative deletions can improve gene expression, being important tools for protein expression in mammalian cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/10809 |
| Date | 13 April 2012 |
| Creators | Quilici, Luana Salgado |
| Contributors | Maranhão, Andréa Queiroz, Brígido, Luis Fernando de Macedo |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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