Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-12-03T15:55:33Z
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DISSERTACAO_2008_HugoDeAlmeidaSilva.pdf: 1378682 bytes, checksum: 3890c0001da50032e86de35c261d77c5 (MD5) / Uma varredura em busca de atividades proteolíticas em bactérias patogênicas e
não-patogênicas do gênero Leptospira identificou a presença de atividade aminopeptidolítica apenas nas primeiras. Visando a esclarecer este achado, o presente trabalho propôs caracterizar bioquímicamente a enzima potencialmente responsável pela atividade leucil-aminopeptidásica presente apenas em sorovares patogênicos de Leptospira. Por meio da clonagem do gene pepA, que codifica uma provável leucilaminopeptidase
(LAP) citossólica, obtivemos a forma recombinante ativa da enzima, que possui características filogenética e bioquímica semelhantes àquelas enzimas da família M17 das metalopeptidases. Assim como outras enzimas dessa família, essa LAP recombinante demonstrou atividade catalítica sobre o substrato L-Leu-AMC, com uma
atividade ótima em pH 8,5, e termofilia com temperatura ótima de 50 °C. Além disso, a
enzima exibiu comportamento típico de cinética clássica de Michaelis-Menten. É
inibida irreversivelmente por EDTA, apesar de outras LAPs serem reativadas por cofatores
iônicos. Aparentemente, a enzima forma um oligômero de 320 kDa, apresentando dependência dessa forma para sua atividade sobre o substrato L-Leu-AMC, em gel de eletroforese. Adicionalmente, foi produzido soro -HaLAP em camundongos isogênicos, demonstrando a antigenicidade da enzima e possibilitando a posterior utilização de anticorpos em outros estudos sobre a expressão diferenciada dessa peptidase durante infecções. Esse trabalho abre caminho para a elucidação de novos mecanismos operando exclusivamente em membros patogênicos de bactérias do gênero Leptospira.
_________________________________________________________________ ABSTRACT / Screening proteolytic activities in non-pathogenic and as well in pathogenic
bacteria of the genus Leptospira, we identified the presence of aminopeptydolitic
activity in the latter only. Aiming at clarification of this finding, this work led to the
biochemical characterization of the enzyme which appears to be responsible for the
leucyl-aminopeptydase activity present in pathogenic Leptospira serotypes. By the
cloning og the pepA gene coding a putative cytosolic leucyl-aminopeptidase (LAP), we
obtained the active recombinant enzyme, showing phylogenetic and biochemical
features similar to those present in the M17 metallopeptidase enzymes family. Like
other enzymes belonging to this family, recombinant LAP revealed catalytic activity
upon L-Leu-AMC substrate, with optimal activity at pH 8.5, and a slight termophilic
behavior, with its optimal temperature at 50 °C. Besides, the enzyme presented typical
Michaelis-Menten kynetics. It is irreversibly inhibited by EDTA, although other LAPs
shows reactivation towards ionic cofactors. Apparently, the enzyme forms a 320 kDa
oligomer, structure which the activity on the L-Leu-AMC substrate in eletrophoresis
gel seems to be dependent. In adittion, the antiserum against -HaLAP produced in
isogenic mice showed its high antigenicty. This finding suggests that the enzyme could
be employed to produce specific antibody, which could be useful in clarifying the
differential expression of the peptidase in the course of severe infections. This work
opens a new avenue that may lead to elucidation of novel mechanisms exclusively
associated with pathogenic species within the genus Leptospira.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/1236 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Silva, Hugo de Almeida |
| Contributors | Lozzi, Silene de Paulino, Santana, Jaime Martins de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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