Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2013. / Submitted by Luiza Silva Almeida (luizaalmeida@bce.unb.br) on 2013-07-31T19:05:31Z
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2013_AnaLuizaSilvaGuimarães.pdf: 2169146 bytes, checksum: 87f2ae8fc25acacc8e11de1b9155d59f (MD5) / O sucesso da utilização da maioria das técnicas de reprodução assistida (TRA) depende da disponibilidade de ovócitos saudáveis e no estágio adequado para seu uso. Como um dos fatores limitantes na utilização das TRAs é a disponibilidade de ovócitos competentes, é importante buscar alternativas para auxiliar esses ovócitos melhorando com isso a eficiência dessas técnicas. O objetivo deste trabalho foi testar dois diferentes sistemas de maturação, o sistema SPOM (Simulated Physiological Oocyte Maturation) e a retenção meiótica na presença de ITS (Insulina-transferrina-Selênio), para aumentar a competência do ovócito e consequentemente incrementar a produção de embriões in vitro. Os ovócitos foram obtidos de ovários de abatedouro, sendo que os provenientes de folículos de 1-3 mm foram dissecados da córtex ovariana e os de 3-8 mm, obtidos por punção folicular. Para a avaliação dos estágios de maturação nuclear, os ovócitos foram corados com lacmóide e para verificar o efeito dos sistemas de MIV na produção de embriões, foi avaliada a taxa de clivagem, blastocisto, tamanho dos embriões e número total de células. O corante azul de Trypan foi utilizado para verificar a viabilidade das células do cumulus após a retenção. Os dados de taxa de maturação nuclear e desenvolvimento embrionário foram avaliados pelo teste do χ 2 , e os dados referentes a tamanho e número de células pelo teste de Kruskar-Wallis. O primeiro sistema de maturação a ser testado foi o sistema SPOM em ovócitos de folículos aspirados, com a dose 0,01 UI/ml de FSH, utilizada na MIV convencional, onde as taxas de clivagem, D7 e D8 foram drasticamente reduzidas (P<0,05) quando comparadas com as do grupo controle. O aumento da dose de FSH para 0,1 UI/ml, no sistema SPOM, em ovócitos obtidos de folículos de 1-3 mm não aumentou a produção de embriões (P0<0,05), entretanto em ovócitos obtidos de folículos de 3-6 mm teve efeito prejudicial, sendo as taxas de clivagem e blastocistos inferiores (P<0,05) as do grupo controle Da mesma forma, quando o SPOM foi utilizado na presença de FSH recombinante (FRSr), de BSA como suplemento dos meios e o cultivo realizado sob baixa tensão de O2, uma redução (P<0,05) na taxa de blastocisto foi observada, mas o tamanho e número de células dos embriões foram semelhantes (P>0,05) aos do controle. A segunda alternativa testada foi o uso da cilostamida, inibidor da PDE3, e ITS no cultivo de pré-maturação por 8 e 24 horas. Na concentração de 20µM, a cilostamida reteve 91% dos ovócitos em VG por até 24 horas, entretanto o desenvolvimento embrionário destes embriões foi comprometido, com baixas taxas de clivagem e de embriões em D7 (P<0,05). Foi também avaliada a diminuição da concentração de cilostamida durante o bloqueio e a presença do ITS. Foi observado que a redução da concentração de cilostamida associada ao período menor de retenção causou um aumento da produção de blastocisto semelhante às taxas obtidas para o controle e que o ITS não afetou (P>0,05) à resposta dos ovócitos a retenção com cilostamida. Conclui-se que o sistema SPOM utilizando FSHr, BSA e baixa tensão de O2 afetou o desenvolvimento embrionário. Além disso, a cilostamida quando utilizada para bloquear a meiose tem efeito deletério nos ovócitos e células do cumulus se utilizada por 24 horas na concentração de 20 μM. A menor concentração (10μM) e menor tempo de exposição (8 horas) pode amenizar esse efeito, mas também não causa nenhum incremento na produção de embriões. A presença de ITS durante o bloqueio não afeta a produção de embriões. Mais estudos devem ser realizados na tentativa de utilizar a retenção para incrementar a qualidade de ovócitos utilizados para as TRAs. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The successful use of most assisted reproductive techniques (ART) depends on the availability of healthy and competent oocytes. Considering that one of the limiting factors for using ART's is the availability of good quality oocytes, it is important to find new alternatives which could help those oocytes and then improving the efficiency of these biotechnology. The aim of this study was to test two different maturation systems, the SPOM (simulated physiological oocyte maturation) methodology and the meiotic inhibition in the presence of ITS (Insulin-Transferrin- Selenium), to improve oocyte competence and consequently, the in vitro embryos production. Oocytes were obtained from slaughter house ovaries, being those from follicles from 3-8 mm diameter were obtained by aspiration and those from 1-3mm follicles by dissection. To evaluate maturational stage oocytes were stained with lacmoid, and to verify the effect of maturation system on in vitro embryos production cleavage rate, blastocyst at D7 and D8 rates, embryo size and total cell number were used. The trypan blued stain was used to evaluate cumulus cells viability after meiotic inhibition. Data of nuclear maturation and embryo development were evaluated by the χ2 test and those of embryo size and total cell number by Kruskar-Wallis test. At first, SPOM system was tested in aspirated oocytes, with 0.01 IU/ml of FSH, used in conventional IVM, where rates of cleavage, D7 and D8 were drastically reduced compared to control (P<0.05). Increasing the dose of FSH to 0.1 IU/ml in the SPOM system did not affect (P<0.05) the results and embryos production remained low. When oocytes from follicles of 1- 3 mm were used, although the embryo rate was low for both group, no effect of SPOM system was observed. However, when recombinant FSH (FSHr) was associated with BSA instead of FCS and culture was performed under low oxygen a reduction (P<0.05) on blastocyst rates were observed, but the size and total cell number were similar to the control (P>0.05). The second alternative to be tested was the use of cilostamide, an inhibitor of PDE3A, associated with ITS on pre- maturation culture for 8 and 24 h. Cilostamide concentration of 20μM retained 91% of oocytes in GV for 24 hours, however, embryonic development and quality of these embryos were compromised presented lower cleavage and blastocyst rates than the control (P<0.05). Decreasing cilostamide concentration and the presence of ITS associated with lower period of meiotic inhibition was also evaluated. It was observed that lower concentration (10µM) during less time of inhibition (8h) caused an increase in embryo production being the rates similar to the control (40.7% vs 51.8%) and that ITS had no effect (P>0.05) oocyte response to cilosminde inhibition. It can be concluded that SPOM using FSHr, BSA and low O2 tension does not affect embryo development. In addition, cilostamide had a deleterious effect in oocytes and cumulus cells when used for 24 h at 20 μM concentration to inhibit meiosis. Lower concentration (10μM) with less time of exposure (8 hours) eliminated the deleterious effect but did not increase embryo production. More studies are needed to establish the use of meiotic inhibition associated with other substances to improve oocyte quality to be use on ART’s.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/13788 |
| Date | 28 February 2013 |
| Creators | Guimarães, Ana Luíza Silva |
| Contributors | Dode, Margot Alves Nunes |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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