Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-01-13T11:52:09Z
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2013_HerdsonRenneydeSousa.pdf: 2689685 bytes, checksum: 872d1a2ad8abc84c2d12fe88886b1e2c (MD5) / Introdução: o grupo de Imunologia Molecular/UnB já produziu anticorpos recombinantes e humanizados de interesse comercial como o anti-CD18, anti-CD3, ou acadêmico como o anti-Z22,assim como fatores plasmáticos humanos. Os vetores de expressão utilizados contêm o promotor de CMV-IA. O objetivo desse trabalho foi explorar regiões formadoras de Z-DNA, e testar diretamente o papel do anticorpo estabilizador de Z-DNA (antiZ22NLS - Z22) no efeito transcricional do promotor CMV modificado (zCMV-IA). Material e Métodos: O primeiro passo foi reconstruir o cassete de expressão dos vetores tradicionais utilizados nesse trabalho, pCO e pCO?600. Para isso, fusionamos o gene GFP ao anticorpo recombinante aCD3. Os passos seguintes foram a introdução de sequências formadoras de Z-DNA (Z1, Z3 e Z4) e controles não formadores de Z-DNA (Z2 e Z5) a montante do promotor CMV-IA. Resultados e Discussão: foram construídos 10 vetores de expressão: 5 construções pCO (pZ1, pZ2, pZ3, pZ4 e pZ5) e 5 construções pCO?600 (?Z1, ?Z2, ?Z3, ?Z4 e ?Z5); transfecção de células CHO-K1 com as construções utilizando Lipofectamina LTX na proporção 1:1 de DNA e reagente LTX; Por fim co-transfecção de células com cada vetor de expressão e vetor pMacZ22NLS e como controle de cada vetor de expressão também foi feita transfecção com vetor pMac vazio. Em comparação aos controles em todas as construções a presença do pMacZ22 NLS aumentou a eficiência de transfecção. Através de citometria de fluxo se verificou aumento da MFI no gate das células GFP+ em até 25 % quando foi co-transfectado vetor com anti-Z-DNA. Conclusão: foi mostrado o papel de anti Z22 como indutor e estabilizador de Z-DNA e seu efeito facilitador da transcrição. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Recombinant antibodies are now a reality in therapeutics. But its production is still a challenging issue. We have been developing expression vectors for heterologous expression of recombinant antibodies based on the CMV promotor. We had previously shown that a Z-DNA forming region upstream the promotor/enhancer enhances luciferase expression in a repórter vector. The aim of this study was to explore Z-DNA forming regions, and directly test the role of a Z-DNA stabilizing antibody on a modified CMV promoter (zCMV). Material and Methods: Initially, the GFP gene was fused with a recombinant antibody anti-CD3 and the fusion cassette was introduced in both pCO and pCO?6OO. Then we introduced the Z-DNA forming sequences (Z1, Z3 and Z4) and control sequences (Z2 and Z5) upstream of the CMV promoter. CHO cells were transfected using Lipofectamine LTX 1:1, DNA and LTX reagent. To provide the trans acting anti-Z-DNA antibody, we cotransfect cells with the vector pMACZ22NLS, that produces a scFv of the anti-Z-DNA mAb Z22 fused to a nuclear localization signal (Intrabody). Flow cytometry was use to follow GFP expression. Results and Discussion: 10 expression vectors were constructed: 5 pCO constructs (pZ1, pZ2, pZ3, pZ4 and pZ5) and 5 pCO?600 constructs (AZ1, AZ2, AZ3, AZ4 and AZ5); The constructions with Z-DNA forming sequences showed an improvement of expression of the reporter gene when compared to the control sequences. Moreover the co-transfection with the anti-Z-DNA vector enhances the MFI of gated GFP+ cells by 25%. Conclusion: The Z-DNA forming sequences improve heterologous gene expression and the presence of anti-Z-DNA in trans was shown to enhance the Z-DNA effect probably due to a stabilization effect.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/14965 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Sousa, Herdson Renney de |
| Contributors | Maranhão, Andréa Queiroz, Brígido, Marcelo de Macedo |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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