Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-02-07T15:24:34Z
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2016_LuzNoemíIrazazabal_Parcial.pdf: 4027818 bytes, checksum: a4a17fcf76040cb0870aeda98cdf7b92 (MD5) / As infecçõesrelacionadas à assistência à saúde e o surgimento de cepas bacterianas resistentes aos antibióticos de uso convencional, representam um dos principais problemas de saúde pública. Neste contexto, os peptídeos antimicrobianos (AMPs) têm sido considerados como uma potencial nova classe de compostos antimicrobianos. Objetivando a geração de novos agentes antimicrobianos potentes e não tóxicos, com potencial terapêutico, estratégias de desenho racional podem ser utilizadas para otimizar AMPs existentes ou para produzir novos AMPs com caraterísticas desejáveis. Nesta perspectiva, foi utilizada uma abordagem racional para gerar três peptídeos sintéticos ([I5, R8] MP, EcDBS1R6 e PaDBS1R1) e avaliar suas propriedades estruturais e funcionais. Mediante a determinação da concentração mínima inibitória (CMI), observou-se que todos os peptídeos mostraram atividade contra bactérias Gram-negativas (CMI = 1,5 – 12,5 μM) e Grampositivas (CMI = 3,125 – 50 μM). Apenas [I5, R8] MP apresentou atividade antifúngica contra Candida albicans com um valor de CMI baixo (12,5 μM). A determinação da concentração de peptídeo capaz de reduzir em 50% a viabilidade celular, revelou baixa ou nula atividade hemolítica (LC50 > 200 μM para os peptídeos [I5, R8] MP e EcDBS1R1; LC50 = 50 μM para PaDBS1R1), e ausência de citotoxicidade frente a células renais embrionárias humanas HEK-293 (LC50 ~ 111 – 143 μM). A cinética da atividade bactericida revelou uma rápida ação bactericida de PaDBS1R1 e [I5, R8] MP frente a E. coli (< 5 e 15 min, respectivamente) e moderada frente a S. aureus (30 e 45 min, respectivamente). No caso de EcDBS1R1, observou-se rápido efeito bactericida para ambas espécies bacterianas (15 min). Os ensaios de permeabilização e despolarização combinados às imagens de microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (MEV-FEG), indicaram que os peptídeos podem ser capazes de alterar a integridade da membrana bacteriana por meio de um mecanismo membranolítico. A análise da estrutura dos peptídeos por espectroscopia de dicroísmo circular e ressonância magnética nuclear, bem como a simulação por dinâmica molecular in silico em ambiente de membrana, revelou uma conformação α-hélice anfipática. Em conclusão, os resultados indicam que a avaliação estrutural e funcional dos AMPs sintéticos racionalmente desenhados, representa uma estratégia promissora para o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos como uma nova classe de fármacos com vista a abordar a problemática da resistência aos antibióticos. / Antimicrobial peptides (AMPs) have been considered as a potential novel class of antimicrobial compounds. In order to generate new potent and non-toxic antimicrobial agents, rational design strategies may be employed. In this view, we used a computational method to design three synthetic AMPs ([I5, R8] MP, EcDBS1R6 and PaDBS1R1). By determining the minimum inhibitory concentration, we found that all the peptides were active against Gram-negative and -positive bacteria. Only [I5, R8] MP was found to display antifungal activity. The determination of the peptide concentration producing 50% of cell lysis revealed low or no hemolytic activity, with no cytotoxicity towards human embryonic kidney cells HEK-293. During time-kill assays more rapid bactericidal effects were observed for PaDBS1R1 and [I5, R8] MP against E. coli compared to S. aureus. For the peptide EcDBS1R6, identical killing curves were obtained for both bacterial strains. Membrane permeabilization and depolarization studies combined with field emission gun scanning electron microscopy (SEM-FEG) revealed that a membranolytic mechanism occurs for these peptides. When analyzed by circular dichroism and nuclear magnetic resonance microscopy or by molecular dynamics simulations during interaction with a membrane model, peptides were shown to adopt an amphipathic alpha-helical conformation. In conclusion, our results indicate that the structural and functional evaluation of rationally designed synthetic AMPs represents a promising strategy for the development of potent novel antimicrobial agents. / Les peptides antimicrobiens sont considérés comme une nouvelle classe prometteuse d’agents anti-infectieux. Afin de développer de nouveaux agents efficaces et non toxiques, des stratégies de conception rationnelle peuvent être utilisées. Dans cette perspective, nous avons utilisé une approche computationnelle pour concevoir trois peptides synthétiques ([I5, R8] MP, EcDBS1R6 et PaDBS1R1). En déterminant la concentration minimale inhibitrice, nous avons montré que tous les peptides sont actifs contre les bactéries Gram-négatif et -positif. Seul [I5, R8] MP a montré une activité antifongique. La mesure de la concentration de peptide provoquant 50 % de mortalité cellulaire a permis de montrer que les peptides étaient faiblement ou non hémolytiques, sans toxicité vis-à-vis des cellules embryonnaires rénales humaines HEK-293. La cinétique bactéricide a révélé que PaDBS1R1 et [I5, R8] MP tuent rapidement E. coli en comparaison à S. aureus et que EcDBS1R6 élimine rapidement les deux souches. Des études de perméabilisation et de dépolarisation combinées à de la microscopie électronique à haute résolution (FEG-SEM) ont montré un mécanisme membranolytique des peptides. L’analyse de la structure des peptides par spectroscopie de dichroïsme circulaire et résonance magnétique nucléaire, ainsi que par modélisation moléculaire lors de leur interaction avec une membrane modèle, révèle une conformation en hélice alpha amphipatique. En conclusion, notre étude indique que l’évaluation structurale et fonctionnelle de peptides antimicrobiens synthétiques conçus de manière rationnelle représente une stratégie prometteuse pour le développement de nouveaux agents antimicrobiens.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/23243 |
| Date | 19 September 2016 |
| Creators | Irazazabal, Luz Noemí |
| Contributors | Ladram, Ali, Franco, Octávio Luiz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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