Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-17T19:50:58Z
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Previous issue date: 2018-07-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes). / Anestesia geral é um recurso fundamental na medicina moderna. Em contraste com o uso de anestésicos há mais de 100 anos, seus alvos e mecanismo de ação moleculares ainda são largamente desconhecidos. Porquanto não se descarte a hipótese de que essas moléculas exerçam seus efeitos por meio de alterações de propriedades físico-químicas de membranas celulares, um conjunto crescente de evidências sugere um cenário alternativo. Neste, o estado de anestesia seria induzido pela modulação direta de múltiplos receptores proteicos. Entre os potenciais receptores, estudos de eletrofisiologia e em modelos animais demonstram que o canal iônico neuronal dependente de voltagem de mamíferos Kv1.2 é modulado diretamente pelo anestésico geral sevoflurano. Esses estudos sugerem que sevoflurano se liga a múltiplos sítios em Kv1.2, resultando em um aumento na probabilidade de abertura do canal, e em um aumento da sua condutância máxima. Nesse contexto, o presente trabalho se propõe a identificar sítios de ligação de sevoflurano nas conformações aberta e fechada de Kv1.2 e investigar quanto da modulação da proteína pode ser explicada pela ligação direta do anestésico, no contexto de um modelo de dois estados. Preambular a essa investigação, no entanto, está o desenvolvimento do arcabouço teórico necessário ao tratamento concentração-dependente da interação de pequenas moléculas a múltiplos sítios de ligação saturáveis, para que se possa quantificar o impacto do modulador no equilíbrio entre conformações da proteína. Da forma como foram descritas, as equações são gerais e facilmente transponíveis a diferentes sistemas de interação proteína-ligante. O estudo mostra, sob uma perspectiva atomística molecular, que sevoflurano se liga com dependência conformacional a Kv1.2. A estabilização do estado aberto promovida pela ligação da molécula anestésica é capaz de recapitular o aumento da probabilidade de abertura do canal verificado experimentalmente. Ademais, os sítios de ligação de sevoflurano a Kv1.2 sugeridos pela estratégia aqui desenvolvida se encontram próximos a resíduos de aminoácido identificados como relevantes à modulação por meio de estudos de mutagênese e marcação com ligantes fotoativos. Em conjunto, os resultados apresentados corroboram a hipótese da modulação direta e contribuem uma perspectiva microscópica para se compreender os efeitos causados por sevoflurano. / Anesthetics are routinely used in medical procedures for almost two centuries. Despite its ubiquity, the molecular mechanism leading to the endpoint of anesthesia remains unknown. While anesthetics might also act by altering cellular membranes’ physicochemical properties, recent studies favor direct allosteric modulation of multiple proteins targets. One such target, evidenced by electrophysiology and in vivo experiments, is the voltage-gated channel Kv1.2. Investigations on sevoflurane, a major general anesthetic, suggest the molecule potentiates Kv1.2 by binding to multiple independent sites, causing a left-shift to the open probability curve (increasing open probability), while also increasing its maximum conductance. Here, we set out to identify Kv1.2 sevoflurane binding sites and quantify the impact of direct modulation in Kv1.2 potentiation. For that, we have developed an original theoretical framework to investigate concentration-dependent interaction of small ligands to multiple saturable protein binding sites which allow for thorough calculation of the functional impact of such binding to equilibrium between well-known conformational states, i.e. open and closed Kv1.2 structures. Anesthetic’s local distribution and binding affinities are evaluated by a combination of docking and free-energy-perturbation calculations. The results suggest sevoflurane binds Kv1.2 in conformationdepend manner. Also, the calculated ligand-effected open-conformation stabilization agrees with experimental measurements, successfully recovering open-probability leftward shift from microscopic data alone. Key binding sites identified by the docking-FEP strategy are also found to be in close proximity to residues identified as relevant by recent photolabeling and mutagenesis experiments. Altogether, results support the direct modulation hypothesis and contributes to understanding sevoflurane effects from a molecular standpoint. Moreover, the theory developed in this work is general and could be applied to various ligand-receptor systems.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/32317 |
| Date | 01 March 2018 |
| Creators | Vieira, Letícia Stock |
| Contributors | Treptow, Werner L. |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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