Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Thaíza da Silva Santos (thaiza28@hotmail.com) on 2009-12-15T19:46:20Z
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Previous issue date: 2007-02-15 / A uricase, uma enzima que converte ácido úrico em alantoína, é comumente usada em kits comerciais de dosagem de ácido úrico. Com a finalidade de produzir esta enzima em grande escala por técnicas de Engenharia Genética, o gene da uricase de Bacillus subtilis subtilis foi clonado e expresso em Escherichia coli. Para tanto, foi feita uma PCR utilizando-se como template o DNA cromossomal de B. subtilis e primers específicos para amplificação do gene pucLM. O amplicon foi sub-clonado seguindo-se seqüenciamento para a confirmação da seqüência do gene e clonagem do gene pucLM no vetor de expressão pET21a. Esse vetor de expressão permite a fusão do gene da uricase com uma cauda de histidina His . O vetor resultante, pETURI, foi usado para 6x transformar as linhagens de E. coli BL21 DE3? pLysS, BL21 (DE3) C41, BL21 (DE3) C43, BL21 (DE3) PRILL e SURE, e a indução da expressão. Amostras da linhagem de E. coli BL21 DE3? pLysS foram selecionadas para o presente estudo. Essas células foram coletadas em diversos tempos de indução e analisadas por SDS-PAGE, que revelou a presença de uma proteína de indução de ~63 kDa. A espectrometria de massa foi utilizada para determinar a massa molecular da enzima recombinante, tendo detectado um íon com massa molecular de 58,67 kDa. Análises de Western Blot confirmaram a presença da cauda de histidina na proteína de indução e detectaram degradação da enzima recombinante na porção N-terminal. A purificação foi realizada em uma coluna de afinidade Ni-NTA. Ensaios enzimáticos detectaram uma proteína estável com pH ótimo 8,0, temperatura ótima entre 25ºC e 37ºC e atividade uricásica na fração eluída com atividade específica de 39 U/mg. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Uricase, an enzyme that converts uric acid into allantoin, is commonly used in commercial kits for uric acid detection. Aiming to produce this enzyme in industrial scale using Genetic Engineering techniques, the uricase gene of Bacillus subtilis subtilis was cloned and expressed in Escherichia coli. In order to achieve this, a PCR was performed using B. subtilis cromossomal DNA as template and specific primers to amplify the gene pucL. The amplicon was sub-cloned following sequencing to confirm the gene sequence and cloning of the gene pucL in vector of expression pET21a. This vector of expression permits the fusion of the uricase gene with a histidine tag His . The resulting vector, pETURI, was used to transform the strains of 6x E. coli BL21 DE3? pLysS, BL21 (DE3) C41, BL21 (DE3) C43, BL21 (DE3) PRILL, and SURE, and the expression was induced by adding IPTG to the culture media. Samples of E. coli BL21 DE3? pLysS strain were selected to be used in the present study. These cells were collected in several induction times and analyzed by SDS- PAGE, which revealed the presence of a ~63-kDa induction protein. Mass espectrometry was used to determine the molecular mass of the recombinant enzyme, having detected an ion with molecular mass of 58,67 kDa. Western Blot analyses confirmed the presence of the histidine tag in the induction protein and detected degradation of the recombinant enzyme in the N-terminal portion. Purification was carried out in Ni-NTA affinity column. Enzymatic essays detected a stable protein with optimum pH 8.0, optimum temperature ranging from 25ºC and 37ºC, and uricase activity in the eluding fraction with specific activity of 39 U/mg.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/3312 |
| Date | 15 February 2007 |
| Creators | Pfrimer, Pollyanna |
| Contributors | Torres, Fernando Araripe Gonçalves |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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