Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-03-09T20:04:02Z
No. of bitstreams: 1
Dissert_Luana Salgado Quilici.pdf: 1672205 bytes, checksum: 72f099a1e67e9f5c8c2d7a7f89b09263 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-03-09T23:12:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1
Dissert_Luana Salgado Quilici.pdf: 1672205 bytes, checksum: 72f099a1e67e9f5c8c2d7a7f89b09263 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-09T23:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1
Dissert_Luana Salgado Quilici.pdf: 1672205 bytes, checksum: 72f099a1e67e9f5c8c2d7a7f89b09263 (MD5)
Previous issue date: 2008 / Foram construídos plasmídios com o promotor de CMV sem intron (pGLCMVI), com intron A (IA) completo (pGLCMV) e deletado em 200 (pGLCMV∆200), 400 (pGLCMV∆400) e 600 pb (pGLCMV∆600), dirigindo a expressão do gene repórter da luciferase, além de diferentes seqüências indutoras de ZDNA localizadas a montante do promotor. Estas construções foram transfectadas de forma transiente em células CHO-K1, COS-7, HepG2 e HEK-293. O IA aumentou em 100 a 1.000 vezes a atividade da luciferase em relação à construção sem intron, dependendo da linhagem celular testada. Dentre as versões deletadas do intron, a construção pGLCMV∆200 foi a mais eficiente, aumentando de 3 a 6 vezes a atividade da luciferase, seguida da construção pGLCMV∆600, cuja atividade melhorou em até 4 vezes, comparado com o IA selvagem. Entretanto, a remoção de 400 pb do IA resultou na redução da expressão gênica a níveis quase comparados aos da construção sem IA. Tomados em conjunto, esses dados sugerem a existência de uma região de ligação a um fator transcricional de inibição no fragmento de 200 pb. Os dados da atividade da luciferase foram corroborados com experimentos de RT-qPCR, que relacionaram o aumento da atividade da enzima com o aumento da expressão do gene nas diferentes construções testadas. O splicing nas construções com IA deletado foi estudado por RTPCR, mostrando que há evidências de que não há processamento correto dos exons 1 e 2 de CMV quando o sítio aceptor é removido. Foi estudado o efeito da remoção da região 5’ do promotor de CMV em CHO-K1 e COS-7, que resultou em uma redução de 50% da atividade da luciferase. Dentre os vetores contendo as seqüências indutoras de Z-DNA que também foram transfectados de forma transiente em CHO-K1, apenas naquele em que foi clonada a seqüência Z3 observou-se um aumento de 50% na atividade da luciferase comparado com a seqüência-controle Z5. Foram desenvolvidos clones estáveis de CHO-K1 com esta construção a fim de verificar o potencial de formação de Z-DNA desta seqüência na região adjacente ao promotor. Nestes clones estáveis, transfectou-se de forma transiente o plasmídeo pMACIA scFvZ22 NLS, um fragmento de anticorpo anti-Z-DNA. A atividade da enzima aumentou em 3 vezes quando este elemento em trans foi adicionado ao sistema de expressão, indicando que esta seqüência realmente forma Z-DNA e que a modulação da expressão gênica ocorre em níveis transcricionais. Portanto, neste trabalho foi mostrado que o IA e suas deleções inovadoras, bem como seqüências indutoras de Z-DNA, podem melhorar a expressão gênica, sendo ferramentas importantes para a otimização da expressão de proteínas de interesse comercial em células de mamífero. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / It had been constructed plasmids with the promoter of CMV and the luciferase reporter gene comprising the following features: without the CMV intron A (IA) (pGLCMV I-), with the full IA (pGLCMV) or the deleted versions of it (pGLCMV∆200, pGLCMV∆400 and pGLCMV∆600), and Z-DNA inducer sequences upstream the promoter. These constructions had been transiently transfected in CHOK1, COS-7, HepG2 and HEK-293 cells. The whole intron A resulted in a 100 to 1000- fold increase in the activity of luciferase compared to the intronless version, depending on the cell line tested. The pGLCMV∆200 construction had also enhanced in 3 to 6-fold the luciferase activity compared to the wild-type IA. Following the results obtained with the construction above, the IA deleted in 600 pb had improved the luciferase activity no more than 4 times, depending on the cell line used. The pGLCMV∆400 construction, instead, resulted in a reduction of gene expression to levels similar to the intronless construction. Taken together, these data suggest that there are a binding region for an inhibitory transcription factor comprising the 200 pb fragment. The data of the activity of luciferase had been corroborated with experiments of RT-qPCR, which had correlated the increases of luciferase activity for the different constructions above with the increase of the expression of the gene of luciferase. To verify the effect of splicing in the constructions with the deleted IA, a RT-PCR experiment was carried through showing that the removal of the donor splicing site might have a relation with the incorrect processing of exons 1 and 2 of the CMV IE gene. Amongst the Z-DNAinducer sequences cloned upstream the CMV promoter, the Z3 sequence resulted in a 2- fold increase of the transient luciferase activity when compared to the control-sequence Z5. As a result, it had been developed stable clones of CHO-K1 cells with this sequence in order to verify if the sequence in question exerts its activity by means of the formation of Z-DNA in the adjacent region to the promoter. In these stable clones, it had been transiently transfected the pMACIA scFvZ22NLS plasmid, that codes for an antibody fragment anti-Z-DNA. The values of the luciferase activity had increased 3 times when this element in trans it was added to the expression system, indicating that this sequence really forms Z-DNA and that the effect observed occurs in transcriptional levels. Therefore, in this work it was shown that the intron A and its innovative deletions, as well as Z-DNA-inductive sequences, can improve the gene expression, being important tools for the optimization of clinical relevant protein expression in mammalian cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/3931 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Quilici, Luana Salgado |
| Contributors | Maranhão, Andréa Queiroz, Brígido, Marcelo de Macedo |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0142 seconds