Orientador: Denise Vaz de Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T04:31:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 1997 / Resumo: A natureza do Poro de Transição de Permeabilidade (PIP) existente em mitocôndrias isoladas tem sido estudada desde a década de 70 até os dias de hoje por diversos autores, sem ainda haver um concenso a respeito de sua composição molecular. Vários trabalhos formularam a hipótese de que o carreador ADP/ATP (AAC) poderia fazer parte da estrutura do PTP. Outros, mostraram que a abertura do PTP poderia ocorrer em situações de isquemia/reperfusão. Porém, na literatura, ainda não foi excluída a possibilidade de estar se estudando um artefato, pois estes trabalhos sempre se basearam no efeito de concentrações suprafisiológicas de Ca2+ (acima de 10 µM) ou seja, concentrações muito distantes das que poderiam ocorrer 'in vivo¿. Neste trabalho, procuramos verificar a ocorrência de abertura do PTP na presença de concentrações fisiopatológicas de Ca2+ (0-500 nM) em condições que simulassem 'in vitro' as conseqüências de um processo de isquemia/reperfusão para as mitocôndrias. Ainda nestas condições, tentamos verificar o envolvimento do AAC na formação do PTP. Para tanto, variamos diferentes parâmetros dos ensaios como: [Ca2+], tempo de pré-incubação na presença do íon e temperatura do meio de reação. A caracterização da abertura do PTP, sensível a ciclosporina A (CsA), foi feita através da medida da velocidade de consumo de O2 nos estados respiratórios 3 e 4 (V3 e V4 respectivamente) e controle respiratório (CR); formação de potencial elétrico de membrana (??), através da captação do cátion lipofílico TPP+ e inchamento mitocondrial. Para verificar como a abertura do PTP, nestas condições experimentais, influenciava a atividade do AAC realizamos uma titulação com CAT (carboxiatractilato) e extração e dosagem de nucleotídeos de adenina. Os resultados mostraram que nossas condições experimentais de baixas concentrações de Ca2+, foram suficientes para induzir abertura do PTP. Aparentemente a ação do Ca2+ é potencializada pelo aumento do período de pré-incubação das organelas com o íon, onde observamos uma diminuição em V3 e ligeiro estímulo em V4, levando à queda no CR; aumento na permeabilidade da membrana a H+ e inchamento mitocondrial de baixa amplitude. Embora muitos trabalhos na literatura tenham mostrado algumas destas interrelações, a originalidade do nosso trabalho está em mostrar, pela primeira vez, a ocorrência da abertura do PTP em condições fisiopatológicas. A diminuição em V3 sugere que nestas condições ocorreu uma inibição na atividade do AAC. Esta inibição poderia ocorrer ou devida a uma diminuição no conteúdo de AAC ativos, que poderia estar se mobilizando para fazer parte da estrutura do poro, ou devida à perda de nucleotídeos de adenina endógenos com a abertura do poro, essenciais para troca obrigatória que o carreador catalisa. Nossos dados mostraram que o período de pré-incubação com concentrações fisiopatológicas de Ca2+, foi suficiente para induzir despolarização da membrana e perda de nucleotídeos de adenina do interior das organelas, sugerindo um envolvimento do AAC com a abertura do PTP nos seus estágios iniciais / Abstract: Although the mitochondrial permeability transition pore (PTP) has been studied since the late 70s, there is no precise knuoledge about its molecular structure. Ischemia and reperfusion process has been pointed as one of the conditions that might trigger the PTP opening and some authors suggest that the ADP/ATP carrier (AAC) is one of the proteins involved in the pore structure. This process is Ca2+- dependent and, due to the high Ca2+ concentrations (above 10 µM) used throughout the literature, the possibility of the PTP be na artifact and not occur 'in vivo', under physiological conditions, could not be excluded. Here we have studied the occurrence of the PTP in the presence of Ca2+ concentration (0-500 nM), under conditions where na ischemia/reperfusion process was simulated and the involviment of the AAC was analysed. The mitochondria were incubated at Ca2+ concentrations, preincubation times in the presence of Ca2+ and at different temperatures. The CsA-sensitive PTP opening was studied through the determination of O2 consumption under respiratory States 3 and 4 (V3 and V4 respectively) and of the respiratory control (RC= v3/v4); through the generation of membrane electrical potential (??), using the uptake of the lipophilic cation TPP+ and also trough the mitochondrial swelling. Under the same conditions the involvement of the AAC was analysed by a titration with carboxyatractilate (CAT) and extration followed by the determination of adenine nucleotide release. Our results showed that these experimental concentrations were enough to open the PTP. It seems that the Ca2+ effect is potencialized by na increase on the mitochondria preincubation time in the presence of the ion, without addition of exogenous respiratory substrates. A decrease in V3 and a slight increase in V4 was observed, leading to a decrease in RC. There was also an increased permeability to H+ and a small amplitude mitochondrial swelling. Although most of these effects have already been reported in the literature, the originality of ours results is to show, for the first time, the PTP occurrence under phisiopathological Ca2+ concentrations. The observed decrease in V3 suggests a possible inhinition of the AAC activity. This could be explained either through a decrease of active carriers beeing mobilized to form PTP or due to endogenous adenine nucleotides loss, which are needed to the exchange the carrier catalyses. Our data show that preincubation under physiopathological concentrations was sufficient to induce a membrane despolarization and loss of internal adenine nucleotides, suggesting the involviment of the AAC at the very beginning of PTP generation / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/314078 |
| Date | 18 December 1997 |
| Creators | El-Khatib, Soraya |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Macedo, Denise Vaz de, 1959- |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 68f., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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