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Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia da Coreia do Sul (MEST) / Governo da província de Gyeonggi da Coreia do Sul / Instituto Coreano de Informação Científica e Tecnológica (KISTI) / Crescentes evidências mostram que a organização espacial da
transcrição é um fator epigenético importante na regulação gênica em
eucariotos. Em células de mamíferos, os genes são transcritos em estruturas
nucleares discretas conhecidas como fábricas de transcrição, e genes com
funções relacionadas e co-regulados compartilham as mesmas fábricas de
transcrição. Plasmodium falciparum apresenta um padrão de expressão
gênica bastante complexo durante o ciclo eritrocítico, contrastando
paradoxalmente com o baixo número de putativos fatores de transcrição
codificados pelo seu genoma. Por outro lado, mecanismos epigenéticos são
importantes na regulação gênica neste parasita. Nesta tese, investigamos a
organização da transcrição em P. falciparum visando determinar se a
organização nuclear está relacionada com a expressão/regulação gênica ao
longo do desenvolvimento do parasita.
Com este objetivo, marcamos transcritos nascentes com BrUTP em
formas eritrocíticas de P. falciparum. Assim como em mamíferos, a
transcrição no parasita também está organizada em focos nucleoplásmicos
discretos, chamados fábricas de transcrição. Análises automatizadas de
imagens em 3D mostram que o número e a intensidade das fábricas de
transcrição variam durante o ciclo eritrocítico, estando correlacionados com o
número de genes expressos em cada estágio, mas não com o volume
nuclear. O baixo número de fábricas indica que os genes ativos compartilham
as fábricas enquanto estão sendo transcritos.
Surpreendentemente, as fábricas são espacilamente redistribuídas
durante o desenvolvimento de anéis para trofozoítas, com a periferia nuclear
sendo a zona de transcrição favorita nos anéis, enquanto nos trofozoítas as
fábricas estão igualmente distribuídas por todo o nucleoplasma. Também
observamos que a transcrição por RNA polimerase I ocorre principalmente
nas áreas centrais dos núcleos em trofozoítas, sugerindo que os
componentes nucleolares podem ser dispersos devido à entrada na fase S.
Assim como nos eucariotos superiores, as fábricas de transcrição em P.
falciparum também se localizam em áreas nucleares com baixa densidade de
cromatina.
Análises de imunofluorescência combinando incorporação de BrUTP
com marcadores nucleares mostram que as fábricas de transcrição formam
um compartimento exclusivo, diferente do compartimento de silenciamento
definido por PfSir2A ou do compartimento de cromatina ativa definido por
H4ac ou H3K79me3. Para estudar a organização espacial da cromatina e
entender como os genes co-regulados interagem com as fábricas de
transcrição, decidimos realizar ensaios de hibridização fluorescente in situ
(fluorescence in situ hybridization, FISH).
Durante a realização de ensaios de FISH seguindo protocolos
publicados, observamos uma grande variação na morfologia nuclear dos
parasitas, o que nos moveu a otimizar esta técnica. Utilizando análises
automatizadas de imagens, mostramos que os parasitas desidratados por
secagem ao ar e fixados por curtos períodos de tempo à temperatura
ambiente apresentam uma variação intra-populacional maior em relação à
forma e ao volume nucleares após o ensaio de FISH, assim como valores de
volume quase duas vezes maiores, do que núcleos de parasitas fixados em
suspensão por longos períodos de tempo e em baixas temperaturas.
Também observamos que a fixação em suspensão leva a uma melhor
conservação da estrutura nuclear, e índices de colocalização mais altos para
duas sondas de repetições adjacentes das extremidades cromossômicas,
Rep20 e telômeros. Em resumo, nossos resultados mostram que o tipo de
protocolo de fixação utilizado antes da realização do desenvolvimento de
FISH é um fator crucial para a conservação apropriada da arquitetura
nuclear. / Growing evidence points that transcription spatial organization is an
important epigenetic factor for eukaryotes gene regulation. In mammalian
cells, genes are transcribed in discrete nuclear structures known as
transcription factories, and developmentally co-regulated, functionally related
genes have been shown to share factories. Plasmodium falciparum shows a
remarkably complex pattern of gene expression during the erythrocytic cycle,
paradoxically contrasting with the low number of putative transcription factors
encoded by its genome. However, epigenetic mechanisms are important for
gene regulation in this parasite. In this thesis, we investigated transcription
organization of P. falciparum in order to determine if nuclear architecture is
related with developmentally regulated gene expression.
To this aim, we have labeled nascent transcrips with BrUTP in P.
falciparum erythrocytic forms. Transcription in organized in discrete
nuceloplasmic foci, the transcription factories. Automated 3D analysis of
confocal images shows the number and intensity of transcription factories
change during the erythrocytic cycle, correlating with the number of genes
expressed at each stage but not with the nuclear volume. The low number of
factories indicates that active genes share factories while being transcribed.
Unexpectedly, factories spatially redistribute from ring to trophozoites,
being the nuclear periphery the preferential transcription zone in rings while in
trophozoites factories are equally distributed throughout the nucleoplasm. We
also observed that RNApolymerase I transcription occurs mostly at central
nuclear areas in trophozoites, suggesting that nucleolar components may be
dispersed upon S phase transition. Like in higher eukaryotes, in P. falciparum
transcription factories occur on nuclear areas with low chromatin density.
Immunofluorescence analysis of P. falciparum nuclear markers
combined with BrUTP incorporation show that transcription factories are a
novel and exclusive nuclear compartment, different from the silent
compartment defined by PfSir2A or the active chromatin compartment defined
by H4ac and H3K79me3. In order to study the spatial organization of
chromatin, and how co-regulated, functionally related genes interact with
transcription factories, we decided to perform fluorescence in situ
hybridization (FISH).
While performing FISH with published protocols, we observed great
variation in the parasite nuclear morphology, prompting us to optimize this
technique. Using automated image analysis, we show that parasites
dehydrated by air-drying and fixed for short periods at room temperature
present after FISH higher intra-population variation of nuclear shape and
volume, as well as almost two-times higher relative volume values, than
parasite nuclei fixed in suspension for long periods at low temperatures. We
also observe that longer fixation in suspension leads to improved
conservation of the nuclear structure, with chromosome end clusters
preferentially locating at the nuclear periphery, and higher colocalization
indexes for two adjacent chromosome end probes, Rep20 and telomere.
Overall, our results show that the type of fixation protocol applied prior to
FISH is crucial for the conservation of nuclear architecture. / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/10960 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Moraes, Carolina Borsoi [UNIFESP] |
| Contributors | Silveira, Jose Franco da [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 147 f. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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