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Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho mostra o envolvimento de motivos de ligação do tipo
NIT2 na modulação da transcrição do gene PbGP43, que codifica um importante
antígeno do patógeno humano Paracoccidioides brasiliensis. Esta investigação foi
motivada pela descoberta de um elevado número de motivos do tipo GATA (ou
TATC) dentro dos 2047 pb da região 5´ intergênica do PbGP43 do isolado Pb339,
presentemente clonado e sequenciado neste trabalho. Este fragmento de 2047 pb
contém 23 sítios NIT2, que formam 4 “clusters” putativos, dois deles idênticos.
Nossa análise foi baseada em ensaios de EMSA (“electrophoretic mobility shift
assay”) usando sondas selecionadas e ensaios de PCR em tempo real do gene
PbGP43 de culturas de P. brasiliensis expostas a, ou depletadas, de sulfato de
amônio e glutamina. Os resultados sugerem que pelo menos alguns motivos NIT2
podem ser funcionais e que o PbGP43 é modulado por fontes primárias de
nitrogênio. Nós mapeamos 4 oligonucleotídeos contendo motivos TATC que
formaram complexos DNA-proteína possivelmente envolvendo um fator NIT2.
Esta afirmação é baseada nas seguintes observações: i) eles formaram bandas
de maior intensidade nos ensaios de EMSA com extrato de células que cresceram
na ausência de sulfato de amônio; ii) uma mutação pontual no núcleo TATC (para
GATC) diminuiu a intensidade das bandas formadas e iii) todos os complexos
migraram de forma semelhante. Tanto sulfato de amônio quanto glutamina
provocaram diminuição no acúmulo de mRNA do PbGP43, sendo que o efeito
pôde ser revertido quando o sal foi retirado do meio. Esta modulação foi vista não
só em Pb339, mas também nos isolados Pb3 e Pb18. Os oligonucleotídeos
usados para iniciar a reação para amplificação dos 2047 pb da região 5´
intergênica do PbGP43 usando DNA do isolado Pb339 também amplificaram um
fragmento de tamanho similar usando DNA do Pb18 e de seis outros isolados.
Para os isolados Pb2, Pb3, Pb4 e Pb5 os amplicons foram de ~1500 pb e para
Pb9 e Pb17 foi de ~3000 pb. No Pb18, esta sequência é 98% idêntica à de
Pb339. No Pb3, além do amplicom de menor tamanho, o número de motivos NIT2
e “clusters” é menor. Ensaios de gene repórter conduzidos em A. nidulans
mostraram que os primeiros 480 pb da região 5´ intergênica não só foram
responsáveis pela transcrição do gene, mas também continham os elementos
necessários para a regulação negativa na presença de sulfato de amônio como
fonte de nitrogênio. Além de terem sido testadas fontes de nitrogênio na
modulação do PbGP43, o efeito da adição de glicose e soro fetal bovino também
foi analisado. Nas condições testadas, o aumento de glicose de 0,18 para 1,5%
levou a uma queda no acúmulo de mRNA do gene, no entanto, o contrário foi
visto quando a concentração do açúcar subiu de 1,5 para 3%. Para o soro fetal
bovino, não houve alteração significativa. Por fim, o mapeamento de elementos
de transcrição da região proximal ao ATG (-1 a –326 pb) pelas técnicas de DNAse
I footprinting e EMSA levaram à identificação de três regiões de proteção
localizadas entre os nucleotídeos –216 e –260 da região promotora proximal. Este
é o primeiro relato de modulação por fontes de nitrogênio primárias do gene
PbGP43. / The present work shows the involvement of NIT2-like binding motifs in
transcription modulation of the PbGP43 gene, which encodes an important antigen
from the human pathogen Paracoccidioides brasiliensis. This investigation was
motivated by the finding of a high number of GATA (or TATC)-like motifs within the
first 2,047 nucleotides of the PbGP43 5’ intergenic region from Pb339 isolate,
which has been presently cloned and sequenced. This fragment contains 23 NIT2-
like sites, which form 4 putative clusters, two of them identical. Our analysis was
based on electrophoretic mobility shift assay (EMSA) with selected probes and
real time reverse transcription (RT)-PCR of PbGP43 from P. brasiliensis cultures
exposed to, or depleted of, ammonium sulfate and glutamine. The results
suggested that at least some NIT2-like motifs may be functional and that PbGP43
is modulated by nitrogen primary sources. We have mapped 4 oligonucleotides
containing TATC motifs that formed DNA-protein complexes possibly involving a
NIT2-like factor. This suggestion is based on the following observations: i) they
formed more intense EMSA bands with extracts from ammonium sulfate-depleted
cells; ii) a point mutation in the TATC core (to GATC) decreased shifted band
intensity; iii) all the complexes migrated similarly. Both ammonium sulfate and
glutamine provoked rapid decrease in PbGP43 mRNA accumulation, but this
effect could be reversed upon salt depletion. This kind of modulation was
observed not only in Pb339, but also in Pb3 and Pb18. The oligonucleotides that
prime amplification of a 2,047-bp PbGP43 intergenic fragment using Pb339 DNA
elongated a fragment of similar size with template from Pb18 and six other
isolates, while for Pb2, Pb3, Pb4 and Pb5 the amplicon was ~1,500 bp and for Pb9
and Pb17 it was ~3,000 bp. The Pb18 genome sequence of this amplicon is 98%
identical to that of Pb339. In Pb3, the number of NIT2-like motifs and clusters is
lower. Gene reporter assays conducted in Aspergillus nidulans WG355 showed
that the first -480 bp of the PbGP43 5´intergenic region are responsible for
promoter activation and contains the minimal elements responsable for down
regulation of gene when tested in minimal medium containing sodium nitrate as
the only nitrogen source. Besides nitrogen sources, alterations in the
concentration of glucose and addition of fetal serum bovine (FSB) in the medium
were tested. In our conditions, when glucose concentration increased from 0,18 to
1,5%, mRNA accumulation decreased. The opposite was seen when
concentration raised from 1,5 to 3%. FSB, on the other hand, did not alter PbGP43
expression. When the proximal promoter region was mapped by DNAse I
footprinting and EMSA, we identified three protected regions localized between –
216 and –260 bp far from the initial codon (ATG). This is the first report on
PbGP43 transcription modulation with primary nitrogen sources. / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/24243 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Rocha, Antonio Augusto [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Puccia, Rosana [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 162 f. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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