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Previous issue date: 2007-02-17 / The main objective of Cryobiology is the optimization of an oocyte cryopreservation
technique. It will permit to create germoplasm banks for maintenance of animal biodiversity,
serving as an important instrument in transgenic, cloned or in vitro produced animals. It is
consensus that the vitrification is the best method to cryopreserve oocytes and that high
cooling rates improve the viability. To evaluate the use of carrier tools with different thermal
conductivity in vitrification, 1.454 oocytes (Experiment 1) were 30 seconds exposed to 10%
EG + 10% DMSO + 20% estrus mare serum (SEE) in TCM Hepes. Just after, groups of 5 or 6
oocytes were exposed (20 seconds) to vitrification solution (SV - 20% EG + 20% DMSO and
0.5M Sucrose). They were loaded in PM (stainless metallic straws, n=265), MV (glass
micropipette, n=279), PB (straw bevel cuted, n=280), OPS (open pulled straw, n=272) or
maintained without vitrification GC (control group n=358). Vitrification was obtained by
plunging it in super cooled liquid nitrogen. In the experiment 2 (n=709) the aim was to
evaluate bovine oocytes vitrification in reduced (25 and 50%) cryoprotectants concentration.
Oocytes were 30 sec. exposed to the first cryoprotectant solution, and just after during 20
seconds to one of the allows vitrification solutions: SV100 (n=187), 20% EG + 20% DMSO +
0.5M Suc; SV75 (n=187), 15% of EG + 15% of DMSO and 0.375M of Suc; or SV50 (n=146),
10% of EG, 10% of DMSO + 0.25M Suc. A non vitrified group (n=189) was used as control.
The re-warming was performed by exposure (5 minutes each) to decreasing sucrose solutions
(0.30 and 0.15M), heated up to 35ºC. The oocytes were then maturated, fertilized, and the
presumptive zygotes cultured in SOFaaci medium, at 39ºC, in saturated humidity. Cleavage,
blastocysts and hatching rates were used as viability criteria. In the experiment 1 there was not
differences in cleavage rates (p>0.05) among treatments, that were lower (P <0.05) than
control group. In the vitrified groups, higher blastocyst rates were obtained with PM treatment
(10.2%), that was lower (P <0.05) than the OPS (6.1%) and PB (6.1%) treatments, not
differing from the MV group (8.0%), although with tendency of be higher (P <0.1). The
treated groups had identical hatching rates, which were lower than the control group. In the
second experiment, there was not difference in the cleavage rate among SV100 and SV75
treatments, being both higher (p <0.05) than the SV50 treatment. In the blastocyst rates, there
was difference among all groups (P <0.05). The higher rate was obtained in control group
(38.0%), followed by the SV100 (10.1%), SV75 (7.6%) and SV50 (0.5%) treatments,
respectively. The hatching rates of SV100 and SV75 groups were similar, being lower (P
<0.05) than control group. In the SV50 group none blastocyst hatched. We conclude that
increasing cooling speed rates improves the viability of immature vitrified bovine oocytes, and
that the metallic straws are more effective than recipients of lower conductivity (plastic
straws), with a tendency of superiority when compared to the glass micropipette. Still, the
reduction of the cryoprotectors in 25% or up does not allow an appropriate cryoprotection to
vitrify bovine oocytes, in the conditions of this study / A otimização da técnica de vitrificação de oócitos é um dos principais objetivos da
criobiologia, pois possibilitará a formação de bancos de germoplasma para manutenção da
biodiversidade animal, além de se constituir num importante instrumento na produção de
animais transgênicos, clones ou programas de produção in vitro de animais. É consenso que a
vitrificação é o método mais adequado para criopreservar oócitos e que elevadas taxas de
resfriamento melhoram a viabilidade da técnica. Para avaliar o uso de materiais com diferentes
condutividade térmica na vitrificação (Experimento 1), 1454 oócitos foram utilizados.
Inicialmente os oócitos foram expostos a 10% EG + 10% DMSO + 20% soro de égua em estro
(SEE), em TCM Hepes, por 30 segundos. Após, grupos de 5 ou 6 oócitos foram submetidos à
solução de vitrificação (SV) composta de 20% EG + 20% DMSO e 0,5M Sacarose, durante 20
segundos, período em foram envasados e mergulhados em nitrogênio super-resfriado. O
envase foi realizado em PM (palheta metálica inoxidável, n=265), MV (micropipeta de vidro,
n=279), PB (palheta cortada em bisel, n=280), OPS (open pulled straw, n=272).
Simultaneamente, um grupo não vitrificado serviu como controle, (GC n=358). No
Experimento 2, 709 oócitos foram vitrificados com concentrações reduzidas (25 e 50%) de
crioprotetores. Inicialmente os oócitos foram expostos, por 30 segundos, a uma solução de
10% EG + 10% DMSO + 20% SEE, em TCM Hepes. Logo após, foram expostos, por 20
segundos, a uma das soluções de vitrificação: SV100 (n=187), 20% EG + 20% DMSO + 0,5M
Sacarose; SV75 (n=187), 15% de EG + 15% de DMSO e 0,375M de sacarose; ou SV50
(n=146), 10% de EG, 10% de DMSO + 0,25M de sacarose, além de um grupo controle não
vitrificado (n=189). O reaquecimento foi realizado pela exposição (5 minutos cada) às
soluções decrescentes de sacarose (0,30 e 0,15M), aquecidas a 35ºC. Os oócitos foram então
maturados e fecundados, e os prováveis zigotos cultivados em meio SOFaaci, à 39ºC. As taxas
de clivagem, de blastocistos e eclosão foram utilizadas com critérios de viabilidade. No
experimento 1 não foram verificadas diferenças (P>0,05) nas taxas de clivagem dos
tratamentos, que foram inferiores (P<0,05) ao grupo controle. A maior taxa de blastocistos nos
grupos vitrificados foi obtida com o tratamento PM (10,2%), que foi superior (p<0,05) aos
tratamentos OPS (6,1%) e PB (6,1%), não diferindo do grupo MV (8,0%), embora com
tendência de ser superior (p<0,1). Também as taxas de eclosão nos grupos tratados foram
semelhantes, sendo inferiores as do grupo controle. No experimento 2, não houve diferença na
clivagem entre os tratamentos SV100 e SV75, sendo ambos superiores (P<0,05) ao tratamento
SV50. Na taxa de blastocistos, houve diferença entre todos os tratamentos (p<0,05). A maior
taxa foi obtida com o grupo controle (38,0%), seguido do tratamento SV100 (10,1%), SV75
(7,6%) e SV50 (0,5%), respectivamente. As taxas de eclosão dos grupos SV100 e SV75 foram
semelhantes, sendo inferiores (p<0,05) ao controle. No grupo SV50 não houve eclosão.
Conclui-se que o aumento da velocidade de resfriamento melhora a viabilidade pós
vitrificação de oócitos bovinos imaturos, sendo que as palhetas metálicas são mais efetivas que
os recipientes de menor condutividade (palhetas plásticas), com uma tendência de
superioridade quando comparada à micropipeta de vidro. Ainda, a redução dos crioprotetores
em percentual igual ou superior a 25% não permite uma adequada crioproteção na vitrificação
de oócitos bovinos, com a metodologia proposta neste estudo
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.udesc.br #179.97.105.11:handle/865 |
| Date | 17 February 2007 |
| Creators | Bunn, Silvério |
| Contributors | Mezzalira, Alceu |
| Publisher | Universidade do Estado de Santa Catarina, Mestrado em Ciência Animal, UDESC, BR, Ciências Veterinárias |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UDESC, instname:Universidade do Estado de Santa Catarina, instacron:UDESC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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