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Tochimara Aparecida Myauchi Dissertacao.pdf: 1469858 bytes, checksum: d9554237da81a72762ef7629c0dfa1b8 (MD5)
Previous issue date: 2012-09-28 / Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nïvel Superior / Parthenogenesis has been described as an alternative method to produce embryos for studies with embryonic cells, particularly in humans which have a restriction of fertilized embryos. Procedures used in parthenogenesis are also required to produce embryos by somatic cell nuclear transfer in domestic species. However, many biological, cellular and molecular aspects of parthenogenetic embryos are still unknown. This study aimed to compare the kinetics of development, apoptosis rate and gene expression of stress and celular metabolism in bovine parthenogenetic embryos and embryos fertilized in vitro. Oocytes (n = 1541) obtained from slaughterhouse ovaries were matured in vitro and submitted to parthenogenetic activation (4.62 µM ionomycin for 5 min followed by 2 mM 6-DMAP for 4 h) or in vitro fertilization (2 x 106 sperm/mL for 20h with semen from a single departure). 72h postactivation/fertilization (hpaf), embryos (8-cell) were frozen for subsequent analysis of gene expression and another part has been separated into groups of high or low potential of development: Part ≥ 8 - parthenogenetic embryos with 8 or more cells (high development potential); Part < 8 - embryos less than 8 cells (low development potential); ≥ 8 IVF - in vitro fertilized embryos with 8 or more cells; and IVF < 8 - embryos with less than 8 cells. Embryos were cultured in CR2aa medium with 2.5% BFS in 5% CO2, 5% O2, 90% N2 at 38.5° C and were evaluated rates of blastocyst 168hpaf (D7) and 196hpaf (D8). 8-cell embryos obtained after 72hpfa were analyzed for gene expression. D8 blastocysts were fixed and subsequently apoptotic index was analyzed by TUNEL. Data were compared by analysis of variance and means by Student Newman Keuls test. Gene expression was evaluated by REST® software. Values are shown as mean ± standard error. Embryos with 8 or more cells produced higher (P < 0.01) blastocysts rates in D7 and D8 compared to embryos with less than eight cells, showing its greatest development potential, regardless if they were parthenogenetic or fertilized. Embryos of Part ≥ 8 group had higher (P <0.05) blastocyst rate in D7 (63.6 ± 3.4%) than IVF ≥ 8 (45.3 ± 8.9%), but at D8 rate was similar (56.7 ± 3.0% and 44.2 ± 8.9% for Part ≥ 8 and IVF ≥ 8, respectively; P <0.05). There was no difference (P < 0.05) on blastocyst rates at D7 and D8 between embryos with less than 8 cells derived from parthenogenesis or fertilization. There was no difference in total cell number (92.0 ± 3.4, 102.30 ± 4.8), apoptotic cells (10.8 ± 1.22, 9.5 ± 1.07) and apoptotic index (11.4 ± 1.27, 9.8 ± 1.8) for parthenogenetic and IVF blastocysts, respectively. In 8-cell embryos analyzed, there was a subexpression of genes DNAJB1, HSPA1L, HSF1 and GLUT1 for Part in relation to FIV, while HSF2 was overexpressed in Part compared to FIV. In conclusion, bovine parthenogenetic embryos differ to embryos fertilized in vitro in hability of preimplantation development in vitro and gene expression, which may limit the use of parthenogenesis in studies of embryonic development. / A partenogênese tem sido descrita como um método alternativo para produzir embriões para estudos com células embrionárias, principalmente em humanos para os quais existe a restrição do uso de embriões fecundados. Procedimentos utilizados na partenogênese são também necessários para se produzir embriões por transferência nuclear com células somáticas nas espécies domésticas. Contudo, muitos aspectos biológicos, celulares e moleculares dos embriões partenogenéticos ainda são desconhecidos. Este estudo objetivou comparar a cinética do desenvolvimento, índice de apoptose e expressão de genes de estresse e metabolismo celular em embriões bovinos partenogenéticos e embriões fecundados in vitro. Oócitos (n=1541) obtidos de ovários de matadouro foram maturados in vitro e submetidos à ativação partenogenética (4,62 µM ionomicina por 5 min seguido de 2 mM 6-DMAP por 4h) ou fecundação in vitro (2 x 106 espermatozoides/ml por 20h, com sêmen de uma única partida). Com 72h pós-ativação/fecundação (hpaf) parte dos embriões (8 células) foram congelados para posterior análise da expressão gênica e outra parte foi separada em grupos de alto ou baixo potencial de desenvolvimento: Part≥8 - embriões partenogenéticos com 8 ou mais células (alto potencial de desenvolvimento); Part<8 - embriões com menos de 8 células (baixo potencial de desenvolvimento); FIV≥8 - embriões fecundados in vitro com 8 ou mais células; e FIV<8: embriões com menos de 8 células. Os embriões foram cultivados em meio CR2aa com 2,5% SFB em 5%CO2, 5%O2, 90% N2 a 38,5ºC e avaliadas as taxas de blastocistos com 168hpaf (D7) e 196hpaf (D8). Embriões com 8 células obtidos após 72hpfa foram analisados quanto à expressão gênica. Blastocistos em D8 foram fixados e posteriormente foram avaliados pela técnica de TUNEL o índice apoptótico. Os dados foram comparados por análise de variância e as médias por teste de Student Newman Keuls. A expressão gênica foi avaliada pelo software REST®. Os valores são mostrados como média±erro padrão. Embriões com 8 ou mais células produziram maiores (P<0,01) taxas de blastocistos no D7 e D8 do que os embriões com menos de oitos células mostrando seu maior potencial de desenvolvimento, independentemente se foram partenogenéticos ou fecundados. Embriões do grupo Part≥8 apresentaram maior (P<0,05) taxa de blastocistos no D7 (63,6±3,4%) que os FIV≥8 (45,3±8,9%), porém a taxa no D8 foi semelhante (56,7±3,0% e 44,2±8,9% para Part≥8 e FIV≥8, respectivamente; (P<0,05). Não houve diferença (P<0,05) quanto às taxas de blastocistos no D7 e D8 entre embriões com menos de 8 células oriundos da partenogênese ou fecundação. Não houve diferença quanto ao número total de células (92,0±3,4; 102,30±4,8), células apoptóticas (10,8±1,22; 9,5±1,07) e índice apoptótico (11,4±1,27; 9,8±1,8) nos blastocistos partenogenéticos e FIV, respectivamente. Nos embriões com 8 células analisados, houve subexpressão dos genes DNAJB1, HSPA1L, HSF1, GLUT1 nos Part em relação aos FIV, enquanto o HSF2 esteve sobrexpresso nos Part quando comparado aos FIV. Conclui-se que embriões partenogenéticos bovinos possuem diferenças se comparados aos embriões fecundados in vitro quanto à capacidade de desenvolvimento pré-implantacional in vitro e expressão gênica, o que pode limitar o uso da partenogênese em estudos sobre desenvolvimento embrionário.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2.unifenas.br:jspui/141 |
| Date | 28 September 2012 |
| Creators | Miyauchi, Tochimara Aparecida |
| Contributors | Camargo, Luiz Sérgio de Almeida, Fernandes, Carlos Antônio de Carvalho, Arashiro, Eduardo Kenji Nunes |
| Publisher | Universidade Jose do Rosario Vellano, Programa de Mestrado em Medicina Veterinária, UNIFENAS, BR, Reprodução Animal |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UNIFENAS, instname:Universidade José do Rosário Vellano, instacron:UNIFENAS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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