Uma das razões que fazem de Saccharomyces cerevisiae um organismo modelo é o grau de conservação dos mecanismos celulares que existe entre esta levedura e eucariotos superiores. Porém, mesmo após 21 anos do seqüenciamento do seu genoma, ainda existem mais de 600 ORFs com função desconhecida. Neste trabalho, selecionamos quatro delas para o estudo detalhado. MRPL34 (YDR115w) está presente na subunidade maior do ribossomo mitocondrial de levedura e apresenta similaridade com o gene L34 de E. coli e MRP-L34 de humanos. O mutante Δmrpl34 apresenta DNA mitocondrial (mtDNA) instável e para estudá-lo foram gerados alelos sensíveis à temperatura (ts). Com os ensaios de síntese protéica mitocondrial in vivo foi possível identificar clara diminuição da síntese de proteínas do mutante condicional. Mrpl34p foi identificada no extrato ribossomal, conforme esperado. A desestruturação da subunidade maior do ribossomo mitocondrial, utilizando os mutantes ts, nos forneceu indícios sobre intermediários existentes no seu processo de montagem. Verificamos que a porção N-terminal da proteína é responsável pelo endereçamento à mitocôndria. YPR116w também apresenta alta instabilidade do DNA mitocondrial, desta forma, mutantes termossensíveis foram utilizados nos experimentos. Uma das estratégias utilizadas visou a busca de parceiros genéticos. Verificamos que ylr091wp aumenta a estabilidade do mtDNA de ts- ypr116w, sugerindo atividade supressora. Também averiguamos que o alelo ts-ypr16w apresenta menor quantidade de tRNA mitocondrial, através de ensaios de Northen blot. Duas das ORFs escolhidas (YDL119c e YOR022c) tiveram sua caracterização inicial publicada em 2016, refletindo a importância deste tipo de pesquisa. Vimos que a proteína codificada por YDL119c está localizada na membrana interna da mitocôndria e que o mutante Δyor022c apresenta quantidades reduzidas de cardiolipina, quando crescido à 37ºC. / One of the reasons that turn Saccharomyces cerevisiae a model organism is the degree of conservation of cellular mechanisms that exist between this yeast and higher eukaryotes. However, even after 21 years of sequencing their genome, there are still more than 600 ORFs with unknown function. In this work, we selected four of them for the detailed study. MRPL34 (YDR115w) is present in the major subunit of the yeast mitochondrial ribosome and bears similarity to the L34 gene of E. coli and MRP-L34 from humans. The Δ mrpl34 mutant shows unstable mitochondrial DNA (mtDNA) and to study it, temperature sensitive alleles (ts) were generated. With the mitochondrial protein synthesis assays in vivo, it was possible to identify a clear decrease in the protein synthesis of the conditional mutant. Mrpl34p was identified in the ribosomal extract as expected. The disassembly of the major subunit of the mitochondrial ribosome, using the ts mutants, provided us some clues about intermediates in its assembly process. We have verified that the N-terminal portion of the protein is responsible for addressing the mitochondria. YPR116w also shows high mitochondrial DNA instability, in this way, thermosensitive mutants were used in the experiments. One of the strategies used was the search for genetic partners. We verified that ylr091wp increases the stability of ts-ypr116w mtDNA, suggesting suppressor activity. We also found that the ts-ypr16w allele has a smaller amount of mitochondrial tRNA, through Northen blot assays. Two of the chosen ORFs (YDL119c and YOR022c) had their initial characterization published in 2016, reflecting the importance of this type of research. We have seen that the protein encoded by YDL119c is located on the inner membrane of the mitochondria and that the Δyor022c mutant presents reduced amounts of cardiolipin when grown at 37 ºC.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-31012018-093718 |
| Date | 05 September 2017 |
| Creators | Raquel Fonseca Guedes Monteiro |
| Contributors | Mário Henrique de Barros, Fernanda Marques da Cunha, Rodrigo da Silva Galhardo, Luis Eduardo Soares Netto, Erich Birelli Tahara |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Microbiologia), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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