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Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A detecção e quantificação do DNA do vírus da hepatite B (HBV) são importantes para o diagnóstico da infecção, definição e monitoramento do tratamento antiviral. Entretanto o diagnóstico molecular é difícil em áreas remotas ou com poucos recursos devido ao custo dos métodos comerciais e pouca infra-estrutura para coleta, armazenamento e transporte de amostras de sangue. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método para quantificação do DNA do HBV em amostras de soro e fluido oral, e avaliar um método qualitativo \201Cin house\201D para detecção do DNA do HBV em comparação com métodos comerciais disponíveis no mercado. Amostras pareadas de soro e fluido oral foram obtidas de 116 indivíduos, onde 66 eram reagentes para HBsAg no soro e 50 não apresentavam nenhum marcador sorológico no soro. As amostras de soro foram submetidas a testes imunoenzimáticos para detecção de marcadores sorológicos do HBV (HBsAg, anti-HBc, anti-HBs, anti-HBcIgM, anti-HBe e HBeAg) e ao PCR em tempo real para quantificação do DNA do HBV (COBAS TaqMan HBV, Roche). O DNA do HBV foi extraído utilizando o conjunto de reagentes \201CHigh Pure Viral Nucleic Acid kit\201D (Roche Diagnostics, EUA) em amostras de soro e \201CRTP® DNA/RNA Virus Mini kit\201D (Invitek, Alemanha) para amostras de fluido oral
Para a detecção qualitativa do HBV foi realizada uma PCR com iniciadores para o gene do core, e para detecção quantitativa do HBV foi utilizada a metodologia de PCR em tempo real com sondas TaqMan® na plataforma Line-Gene 9600 (Bioer Serves Life, Canada). Para obtenção da curva de quantificação foi construído um plasmídeo recombinante obtido a partir de amostras padrão do painel de quantificação do HBV (Optiquant HBV, Acrometrix, Life Technologis, EUA). As seguintes condições da PCR em tempo real foram avaliadas: concentração de DNA (5 e 7,5\03BCL), temperatura de hibridização (60°C e 62°C), e números de ciclos (40 e 45 ciclos). A sensibilidade analítica da PCR em tempo real foi estimada em 10 cópias de HBV DNA/mL e a faixa de quantificação abrangeu cerca de 8 logs de 10. Para quantificação do DNA do HBV em soro e fluido oral foi necessário o aumento da temperatura de hibridização, e para o fluido oral também foi necessário o aumento da concentração de DNA (7,5 \03BCL) e do número de ciclos (45). Entre as amostras de soro HBsAg reagentes, 64 foram quantificadas pela PCR em tempo real comercial e 28 pelo teste quantitativo \201Cin house\201D com carga viral média igual a 3,993 ± 1,922 e 3,761± 1,829 log cópias de HBV DNA/mL (r=0,7643; p<0,0001), respectivamente, e concordância de 37,87%
Por outro lado, 8 amostras de fluido oral amplificaram pelo método quantitativo \201Cin house\201D, com carga viral média igual a 4,459 ± 1,127 log cópias de HBV DNA/mL (r=- 0,2994; p= 0,9453). A PCR qualitativa \201Cin house\201D foi capaz de detectar o DNA do HBV em 50 amostras de soro HBsAg reagentes apresentando 75% de concordância com o teste comercial quantitativo (p=1,000), porém somente uma amostra de fluido oral foi detectada por este método. Concluímos que as metodologias qualitativa e quantitativa para detecção do DNA do HBV analisadas neste estudo apresentaram boa eficiência em amostras de soro, porém não foram eficientes em amostras de fluido oral. Estas metodologias podem ser bastante úteis para detecção molecular do HBV em áreas com recursos limitados / The detection and quantification of the DNA of Hepa
titis B virus (HBV) are important to
diagnose the infection, determine and monitore the
antiviral treatment. However, the
molecular diagnosis is difficult in remote areas or
presenting low resources, because of
the cost of commercial methods and few infrastructu
re for collection, storage and
transport of blood samples. The objective of this s
tudy was to develop a method for
quantification of HBV DNA in serum and oral fluid s
amples, and to evaluate an in house
qualitative method for HBV DNA detection compared t
o commercial methods available in
the market. Paired serum and oral fluid were obtain
ed from 116 individuals, where 66
were HBsAg reactive in their sera and 50 did not pr
esent any HBV serological marker in
sera. Serum samples were submitted to enzyme immuno
assays for detection of HBV
serological markers (HBsAg, anti-HBc, anti-HBs, ant
i-HBcIgM, HBeAg and anti-HBe) and
quantified by commercial real time PCR (COBAS® TaqM
an HBV Test, Roche
Diagnostics, EUA). HBV DNA was extracted using the
commercial kit "High Pure Viral
Nucleic Acid Kit" (Roche Diagnostics, USA) in serum
samples and "RTP ® DNA / RNA
Virus Mini Kit" (Invitek, Germany) for oral fluid s
amples. For HBV qualitative detection it
was employed a PCR using primers for Core gene, and
for quantitative detection of HBV
it was employed a real time PCR methodology with Ta
qMan ® probes in the Line-Gene
9600 (Bioer Serves Life, Canada) platform. To obtai
n the quantification curve, a
recombinant plasmid was constructed using standard
quantification panel of HBV
(Optiquant HBV, Acrometrix, Life Technologis, USA).
The following PCR conditions were
evaluated in real time PCR: DNA concentration (7.5
and 5 μL), annealing temperature
(60° C and 62° C), number of cycles (cycles 40 and
45). The analytical sensitivity of real-
time PCR was estimated at 10 HBV DNA copies/mL and
the quantitation range
comprised about 8 logs of 10. For quantification of
HBV DNA in serum and oral fluid, it
was necessary to increase the annealing temperature
, and for oral fluid, it was also
necessary to increase the concentration of DNA (7.5
μL) and the number of cycles (45).
Among HBsAg reactive serum samples, 64 were quantif
ied by commercial real time PCR
and 28 by “in house” quantitative test, with mean v
iral load equal to 3,993 ± 1,922 e
3,761± 1,829 log copies of HBV DNA/mL (r=0,7643; p<
0,0001), respectively, and
concordance of 66.6%. Moreover, eight oral fluid sa
mples were amplified by quantitative
"in house" method, with average viral load equal to
4,459 ± 1,127 log copies of HBV
DNA/mL (r=-0.2994, p=0,9453). The qualitative "in h
ouse" PCR was able to detect HBV
DNA in 50 HBsAg reactive serum samples, showing 75%
of agreement with the
commercial test (p=1.000), but only 1 oral fluid sa
mple has been detected by this
method. We concluded that the qualitative and quant
itative methods for the detection of
HBV DNA analyzed in this study presented good effic
iency in serum samples, but they
were not effective among oral fluid samples. These
methodologies can be useful for
molecular detection of HBV in areas with limited re
sources
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12023 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Portilho, Moyra Machado |
| Contributors | Araújo, Natalia Motta de, Filippis, Ana Maria Bispo de, Leon, Luciane Almeida Amado, Guimarães, Monick Lindenmeyer, Ferreira, Davis Fernandes, Villar, Lívia Melo |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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