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Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Quimiocinas são citocinas envolvidas em processos inflamatórios e homeostásicos. Estudos in vitro vêm demonstrando a influência desses mediadores na alteração da permeabilidade endotelial na infecção pelo vírus dengue (DENV). Dengue é uma doença de amplo espectro clínico, variando desde uma infecção assintomática a casos graves, com manifestações hemorrágicas e/ou extravasamento plasmático e, em menor frequência, ao óbito de pacientes. O objetivo de nosso projeto foi avaliar o envolvimento de quimiocinas séricas presentes em pacientes infectados pelo DENV na alteração da permeabilidade transendotelial, utilizando células endoteliais primárias num sistema in vitro. Para isso realizamos estudo populacional para obtenção de amostras de sangue de casos suspeitos de dengue durante epidemia de 2013 e de indivíduos sadios. Após confirmação laboratorial, foi realizada classificação clínica dos casos segundo a OMS 2009. No soro dos pacientes e controles foi realizada quantificação dos níveis das citocinas TNF-\03B1, IL-1\03B2 e IL-10 e das quimiocinas CXCL8/IL-8, CCL2/MCP-1, CXCL10/IP-10 CCL5/RANTES e CX3CL1/Fractalcina por ELISA ou LUMINEX. Para os ensaios de permeabilidade, foram feitos cultivo e manutenção de células endoteliais primárias HMVEC-d para padronização do ensaio, através da medida da resistência elétrica transendotelial (TEER). Na tentativa de avaliar a contribuição das quimiocinas na medida do TEER, foram adicionados sobre monocamada de HMVEC-d com 80% de confluência em sistema Transwell, 20% de soro de pacientes pré-tratados ou não com bloqueadores de CCL4/MIP-1\03B2, CXCL10/IP-10, CX3CL1/Fractalcina, CCL5/RANTES e IgG e feito uma cinética. Brevemente, foram confirmados 181 pacientes, com predominância do DENV-4, distribuídos segundo a OMS em: 125 febre do dengue sem sinais de alarme (FD), 54 FD com sinais de alarme (FDSA) e 2 dengue grave (FDSA/Grave)
De forma interessante, a infecção pelo DENV-4 sugeriu características clínicas e laboratoriais mais brandas comparadas a epidemias por outros sorotipos. Independentemente da gravidade, os pacientes DENV-4 apresentaram altos níveis de TNF-\03B1, IL-10, CCL2/MCP-1, CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10 e CX3CL1/Fractalcina, mas não de IL-1\03B2 e CCL5/RANTES comparado aos controles saudáveis. Nossa estratégia para avaliar a capacidade de alterar a permeabilidade das monocamadas de HMVEC-d foi agrupar os pacientes em dois grupos, altos (n=5) e baixos (n=5) produtores de TNF-\03B1, IL-1\03B2 e CXCL8/IL-8. Surpreendentemente, os níveis séricos de TNF-\03B1, IL-1\03B2 e CXCL8/IL-8 parecem não influenciar a medida do TEER. Dos 10 pacientes, 4 não alteraram a medida do TEER e 6 alteraram em algum momento da cinética. O bloqueio das quimiocinas parece não ter influenciado a medida do TEER nas condições estabelecidas. Análises de correlação indicaram uma tendência dos níveis séricos de IL-1\03B2 e CXCL8/IL-8 e CX3CL1/Fractalcina protegerem a monocamada das alterações, enquanto essa proteção parece ter sido mais efetiva em relação aos níveis séricos CCL5/RANTES. O conjunto desses dados nos indica que o DENV-4 parece levar a uma dengue na forma mais branda nos pacientes, aliado a uma redução de parâmetros clínico-laboratoriais associados à gravidade. Citocinas e quimiocinas estão presentes em altos níveis séricos nestes pacientes e parecem ser autorreguladas. Dentre os mediadores inflamatórios, quimiocinas como CCL5/RANTES parece influenciar de forma impactante a alteração da permeabilidade de células endoteliais, o que não foi confirmado pelos ensaios de bloqueio, mas pela correlação direta dos níveis séricos de CCL5/RANTES com a medida do TEER / Chemokines are cytokines involved in
homeostatic and inflammatory processes
.
In
vitro
studies have demonstrated the influence of these mediators in the alteration of
endothelial permeability in Dengue virus (DENV) infection. Dengue is a wide clinical
spectrum disease, ranging from an asympto
matic infection to severe cases with
hemorrhagic manifestations and / or plasma extravasation that could result in death of
patients. The aim of our project was to evaluate the involvement of serum chemokines
present in patients infected with DENV in chang
ing the transendothelial permeability
using primary endothelial cells
in vitro
system.
To
population
-
based study conducted to
obtain blood samples from suspected dengue cases during the epidemic of 2013 and
the control group. After laboratory confirmation,
clinical classification was made of the
cases according to the WHO 2009. In the serum of patients and controls was
performed quantification of levels of the cytokines TNF
-
α, IL
-
1β and IL
-
10 and
chemokines CXCL8/IL
-
8, CCL2/MCP
-
1, CXCL10/IP
-
10, CCL5/RANTES
and
CX3CL1/Fractalkine by ELISA or LUMINEX. For the permeability tests were made
cultivation and maintaining prim
ary endothelial cell (HMVEC
-
d) and
measuring
transendothelial electrical resistance (TEER). In order to assess the contribution of
chemokines i
n
the extent TEER were added to monolayer HMVEC
-
d at 80%
confluence in Transwell System, 20% serum from patients pretreated or not with
blocking CCL4/MIP
-
1β, CXCL10/IP
-
10, CX3CL1/Fractalkine, CCL5/RANTES and IgG
made kinetics. Briefly, 181 patients were co
nfirmed, with a predominance of DENV
-
4,
distributed according to the WHO in: 125 dengue fever without warning signs (FD), 54
FD with alarm signals (FDSA) an
d 2 severe dengue (FDSA/Severe)
. Interestingly,
infection with DENV
-
4 suggested clinical and laborat
ory characteristics milder
compared to epidemics by other serotypes. Regardless of gravity, DENV
-
4 patients
presented high levels of TNF
-
α, IL
-
10, CCL2/MCP
-
1, CXCL8/IL
-
8, CXCL10/IP
-
10 and
CX3CL1/Fractalkine, but not IL
-
1β and CCL5/ RANTES compared to healt
hy controls.
Our strategy to assess the
capacity change
the permeability of monolayers HMVEC
-
d
was to group the patients into two groups, high (n = 5) and low (n = 5) TNF
-
α
producers, IL
-
1β and CXCL8 / IL
-
8. Surprisingly, the serum levels of TNF
-
α, IL
-
1β
and
CXCL8/IL
-
8 did not significantly influence the measurement of TEER. Of the 10
patients, 4 did not alter the extent TEER and 6 changed at some point in kinetics.
Blocking chemokine did not influ
ence the measurement of TEER on the
established
conditions.
Correlation analysis indicated a trend of serum levels of IL
-
1β patients and
CXCL8/IL
-
8 and CX3CL1/Fractalkine protect monolayer of changes, while this
protection appears to have been more effective with respect to serum CCL5/RANTES.
These data suggest th
at the DENV
-
4 appears to lead to dengue in milder form in
patients, combined with a reduction of clinical and laboratory parameters associated
with severity. Chemokines and cytokines are present in high serum levels in these
patients and seem to be autorre
gulated. Among inflammatory mediators, such as
chemokine CCL5/RANTES impactful seems to influence the change in permeability of
endothelial cells, which was not confirmed by blocking assays, but for the direct
correlation of serum levels of CCL5/RANTES wit
h the measure of TEER
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13351 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Cipitelli, Márcio da Costa |
| Contributors | Lima Junior, Josué da Costa, Monteiro, Carmen Penido, Almeida, Nogueira Ana Cristina Martins de, Luca, Paula Mello de, Santos, Flavia Barreto dos, Pinto, Luzia Maria de Oliveira |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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