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Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / No presente trabalho foram detectadas cisteína-proteinases (CPs) em promastigotas infectivas de Leishmania (Viannia). braziliensis. A estratégia de purificação consistiu na associação do método de extração por Triton X-114 com cromatografia em coluna de Concanavalina A-Sepharose, seguida por outra de DEAE-Sephacel. No ensaio das cromatografias, observamos um pico majoritário de atividade enzimática na presença do substrato pEFLpNan (165 x 10³² \03BCM de pNan/minuto) para cerca de 10¹0 parasitas, coincidentes com o pico majoritário da proteína eluído da coluna de troca iônica. A análise por SDS-PAGE do material eluído da coluna de troca iônica mostrou quatro principais bandas de proteínas com massas moleculares relativas de 63, 43, 30 e 27 kDa. Os ensaios da atividade enzimática após eletroforese mostraram que as bandas de 63 kDa e 43 kDa, hidrolisam substratos como gelatina em pH 7,0 e são sensíveis à presença de E-64. Além disso, as duas enzimas são capazes de hidrolisar o substrato pEFLpNan: 63 kDa (2,2 ± 0,3 \03BCM de pNan/minuto) e 43 kDa (0,05 ± 0,2 \03BCM de pNan/minuto), e são inibidas por 10\03BCM E-64 (47 % e 36 % respectivamente). Os ensaios de reconhecimento imunológico utilizando um anti-soro policlonal específico contra cisteína-proteinase B [anti-CPB de L. (L.) mexicana] revelaram que as enzimas de 63 kDa são reconhecidas por este anti-soro. Os experimentos de aglutinação, citometria de fluxo e imunocitoquímica utilizando esse mesmo antisoro revelaram que homólogos de CPBs estão localizados na superfície da membrana de promastigotas. Além disso, a incubação dos promastigotas com fosfolipase C (PLC) reduziu o número de células positivas pra os homólogos de CPB.
Os anti-soros anti-CRD (cross reactive determinat) e anti-CPB reconhecem bandas de 63kDa e 43 kDa do sobrenadante das células tratadas com PLC em ensaios de immunoblotting sugerindo que isoformas destas proteínas são ancoradas por glicosilfostatidilinositol (GP (GPI) à membrana plasmática. Também observamos que os homólogos de CPBs são presos a membrana por âncora GPI e se concentram em plataformas lipídicas. Nós observamos que as proteínas homólogas a CPB não permanecem estáveis na superfície da membrana quando os parasitas são mantidos em culturas sucessivas, assim como a atividade enzimática total sobre o substrato pEFLpNan é alterada. Mostramos ainda através da técnica RT-PCR em tempo real um aumento da transcrição de cpb de L. (V.) braziliensis quando os parasitas foram submetidos a culturas sucessivas. De uma forma geral os dados apresentados suportam a hipótese de que o parasita estudado apresentam CPs de membrana ativas, além de homólogos de CPB intracelulares. / It was detected cysteine-pro
teinases (CPs) in infective
Leishmania (Viannia) braziliensis
promastigotes
.
The purification strategy c
onsisted of an association
of Triton X-114 extraction
method with chromatography in Concanavalin A-Sepharose column, followed by
chromatography in DEAE-Sephacell column. In
the assay pf chromatographic fractions, we
observed a peak of enzymatic activity
against the pEFLpNan substrate (165 x 10
-32
μM of
pNan/minute) in over 10
10
parasites, coincident with the ma
jor protein peak eluted from the
column. SDS-PAGE analysis of the material eluted
from the ionic exchange column showed four
main protein bands with relative molecular
mass of 63 , 43, 30 and 27 kDa. Gelatin-SDS-PAGE
assays indicated that the 43kDa and the 63kDa bands
can hydrolyze gelatin at neutral pH and are
sensitive to E-64. Also, both enzymes can hydrolyze pEFLpNan substrate: 63 kDa (2,2 ± 0,3 μM
of pNan/minute) and 43 kDa (0,05
± 0,2 μM of pNan/minute) bei
ng both inhibited by E-64 (47 %
and 36 % inhibition, respectively)
. Immunological recognition assays
, with a specific polyclonal
antibody against CPB from
L. (L.) mexicana
, showed that bands of 63 kDa and 43 kDa are
recognized in the fractions of
the ionic exchange column. Aggl
utination, flow cytometry and
immunocytochemistry assays performed with an
ti-CPB antiserum revealed that homologous of
CPB are located on the promastigote membrane
surface. Moreover, the incubation of
promastigotes with phospholipase C reduced th
e number of CPBs homologues-positive cells.
Both anti-cross-reacting determinant (CRD) a
nd anti-CPB antisera recognized 63kDa and 43kDa
bands in the supernatant of phospholipase C-treat
ed cells, suggesting that isoforms of these
proteins are attached to the plasma membra
ne by glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchors.
Also, our data suggest that GPI-anchored CPBs are present in the
detergent
-
resistant
lipid rafts.
We observed that the CPB homologues do not remain stable on the membrane surface when the
parasites are maintained under successive cultur
es; also, the total enzymatic activity over the
substrate pEFLpNan is altered. We add
itionally showed by real-time RT-PCR that
L. (V). braziliensis
cpb
genes are active and their
relative expression is increased throughout the
successive cultures. Thus, the presented data
support the hypothesis of that studied parasite
presents CPs of membrane active,
beyond homologous of intracellular CPB.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13496 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Rebello, Karina Mastropasqua |
| Contributors | Brazil, Reginaldo Peçanha, Faria, Suzana Côrte-Real, Castro, Helena Carla, Genta, Fernando Ariel, Calabrese, Katia da Silva, Alves, Carlos Roberto |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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