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Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Na+, K+ ATPase (NKA) atua na manutenção do potencial de membrana das células e em mecanismos de transdução de sinal. Alterações na atividade da NKA são importantes em muitos processos biológicos e patológicos. A NKA pode ser inibida pelo álcool perílico (POH), um monoterpeno utilizado no tratamento de tumores, incluindo cerebrais. Neste trabalho, determinamos que o POH também atua sobre cascatas de sinalização, moduladas via NKA, que controlam a proliferação e/ou morte celular. Foi avaliado o efeito do POH e do PA seu principal metabólito, sobre a atividade da NKA em duas linhagens de células de glioblastoma (GBM) humano (U87 e U251), células não tumorais de astrócitos de camundongo e da linhagem (VERO). Nossos resultados, baseados na avaliação da atividade da NKA por incorporação do Rb+, o qual mimetiza o K+, mostraram uma sensibilidade à inibição pelo POH semelhante entre os quatro tipos de células (IC50 U87 2 mM; U251 1,8 mM; VERO 2,4 mM e astrócitos de camundongo 1,4 mM), enquanto o PA não apresentou efeito. Sabe-se que nos GBMs existe uma superexpressão da subunidade \03B11 da NKA, situada na estrutura das cavéolas que é provavelmente responsável pelo papel sinalizador atribuído a essa enzima, especialmente em relação aos mecanismos apoptóticos. Comparamos a viabilidade celular, determinando a atividade da enzima lactato desidrogenase presente no sobrenadante das células tratadas por 24 h com POH e PA
O PA não alcançou efeito citotóxico igual ou superior a 30% nas células mesmo na concentração elevada de 4 mM. Já o POH reduziu, de maneira dependente da concentração, a viabilidade das células (IC50 U87 1,1 mM; U251 1,4 mM; VERO 0,9 mM e astrócitos de camundongo 1,4 mM). Na análise por western blot, 1,5 mM de POH ativou a proteína c-Jun N-terminal quinase (JNK), nas células U87, U251 e nos astrócitos de camundongo (incubação de 30 min). O uso do inibidor Src quinase (dasatinibe) e a depleção colesterol da membrana celular com metil \03B2-ciclodextrina reduziram a ativação da JNK1/2 induzida pelo POH nas células U87, indicando a possível participação do complexo NKA-Src (presente nas cavéolas), nesta via de sinalização. POH (1,5 mM) aumentou a liberação da interleucina IL-8, detectada por ELISA, no sobrenadante das células U251 (24 h incubação), indicando possível estratégia destas células para evitar o efeito citotóxico do POH. Resultados obtidos com citometria de fluxo mostram que a inibição da JNK1/2 (pelo inibidor JNK V) reduz a apoptose ocasionada pelo POH nas células de GBM, indicando o envolvimento desta proteína na morte celular programada. Os resultados obtidos mostram que o mecanismo de sinalização celular mediado pela NKA pode ter um importante papel no mecanismo de ação antitumoral do POH em células de GBM / The Na
+
, K
+
ATPase
(NKA) acts in keeping the cell membrane potential
and in signal
transduction mechanisms
. Modifications in the
activity of this enzyme are important in
physiological and patholog
ical processes. The
NKA
is inhibited by perillyl a
lco
h
ol
(POH), a
monotherpene
used in the treatment of tumors, including brain tumors.
In
this work
,
we also show
that POH act
s
in signal
ing cascades associated to NKA,
controlling cell proliferation and/or
cellular death. We evaluated the effect of POH and
o
f its main metabolite (peri
l
lic acid
-
PA) on the NKA a
ctivity in cultured glioblastoma
cells
(
GBM)
U87
and
U251 and on non
-
tumor cells (mouse astrocytes and VERO
cells)
.
N
AK activity was measured by non
-
radioactive Rb
+
incorporation
by cells
(Rb
+
is a K
+
substitute). Our results showed a similar sensitivity for the four cells types
tested
(IC
50
U87
–
2
mM; U251
-
1,8
mM; VERO
-
2,4
mM and mouse
astrocy
tes
-
1,4
mM). Peri
l
lic acid did no
t show any effect i
n any cell type.
In GBMs
,
it is known
that NKA
α
1
subunit is super
expressed. Thi
s isoform is embedded in caveolar
structures and is probably responsible by the signaling properties of this enzyme in
apoptosis mechanisms.
Cell viability was
measured by lactate dehydr
o
genase in cell
supernatants of
POH
treated cells. The maximum PA cy
totoxic effect
obtained
was
30% even at 4
mm.
However,
POH
reduced dose dependently
cell
viability
, (IC
50
U87
-
1,1
mM; U251
-
1,4
mM
; VERO
-
0,9
mM and
mouse astrocyte
-
1,4
mM).
Considering the western blot analysis, 1,5
m
M POH activated the
c
-
Jun N
-
terminal
K
inase (JNK),
on
U87,
U251 and in mouse astrocy
tes
after
30min incubation
.
D
a
satinib (an inhibitor of
Src
K
inase) and methyl
β
-
ci
clodextrin
(which promotes
cholesterol depletion in
cell membrane
s
) reduced JNK
1/2
activation induced by POH
in U87 cells, indicating the participation of NKA
-
Src
comp
lex seen in caveolar
structure
in this mechan
ism.
1,5mM
POH
a
fter 24h incubation incr
ease interleuk
in IL
-
8 in U251 cell supernatant, and this may indicate a possible strategy to avoid the
cy
totoxic effect of POH.
Results obtained by flux cy
tometry
showed
that
the
inhibition
of
JNK1/2
(by the inhibitor JNK
V) reduced apoptosis consequent to
POH
administration in GBM cells, indicating the involv
e
ment of this protein in
programmed
cellular death.
Our results seem
to indicate that
a
signaling mechanism mediate
d
by
NKA may have an important role in ant
i
-
tumor
al
action of POH in GBM cells. / GARCIA, D. G. Sinalização de morte celular via NA+, K+-ATPase como alvo de drogas anticâncer: estudos com o álcool perílico. 2013. 86f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2013
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13622 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Garcia, Diogo Gomes |
| Contributors | Almeida, Cecília Jacques Gonçalves de, Fernandes, Janaina, Ferreira, Luiz Roberto Leão, Silva, Adriana Ribeiro, Gallo, Cláudia Vitória de Moura, Faria Neto, Hugo Caire de Castro |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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