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Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Mycobacterium leprae, agente etiológico da hanseníase, expressa em abundância uma proteína catiônica semelhante às histonas, denominada Hlp, presente tanto no envelope como no nucleóide bacteriano. O reconhecimento do DNA bacteriano, rico em motivos CpG não metilados, pelo receptor TLR-9 representa uma importante via para a ativação da resposta imune inata, a qual pode levar à eliminação do agente infeccioso ou mediar manifestações patológicas. Foi mostrado ainda que complexos DNA-histona são mais potentes agonistas de TLR-9 que DNA sozinho. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar o envolvimento do receptor TLR-9 na ativação da resposta imune do hospedeiro durante o curso da infecção pelo M. leprae. Inicialmente foi analisada a participação do TLR-9 na ativação da resposta imune inata em células epiteliais alveolares da linhagem A549 após estímulo com M. leprae. M. leprae foi capaz de induzir aumento das quimiocinas IL-8 e MCP-1 e a transcrição gênica do peptídeo antimicrobiano H\F062D-2 nas células epiteliais. O aumento da expressão de CD80 na superfície celular também foi observada após estímulo com o bacilo. O complexo CpG-Hlp micobacteriano solúvel também induziu aumento na produção de IL-8 nas células A549. Foi observado que o aumento de IL-8 induzido pelo M. leprae ocorre de forma dependente da translocação nuclear do NF-\F06BB e que o antagonista sintético de TLR-9 afetou a secreção de IL-8 induzida pelo M. leprae. A adição de CpG ao M. smegmatis selvagem, mas não mutante para o gene hlp, aumentou a produção de IL-8 pelas células epiteliais
Em conjunto, esses dados sugerem que as células epiteliais respiratórias podem reconhecer M. leprae via TLR-9 e, assim, participar da resposta imune inata no sítio inicial da infecção. Uma vez que o aparecimento do eritema nodoso hansênico (ENH) está associado a liberação massiva de antígenos micobacterianos, foi investigado o envolvimento do TLR-9 na patogênese do ENH. Neste sentido, foi verificado o aumento da expressão de TLR-9, tanto em lesões de pele como em células mononucleares periféricas de pacientes reacionais, quando comparados com pacientes não reacionais. Posteriormente foram quantificados os níveis de ligantes de TLR-9 na circulação dos pacientes. Além de DNA de M. leprae, altos níveis de Hlp foram detectados no soro de pacientes reacionais. Como o TLR-9 também reconhece DNA endógeno, os níveis circulantes do complexo DNA-histona humano foram quantificados e observou-se um aumento destes complexos no soro de pacientes reacionais. Demonstramos que PBMCs de pacientes reacionais secretam níveis aumentados das citocinas TNF-\F061, IL-6 e IL-1\F062 em resposta ao complexo CpG-Hlp em comparação a pacientes não reacionais e indivíduos sadios. Finalmente, o antagonista sintético de TLR-9 inibiu a secreção das citocinas pelas PBMCs em resposta ao lisado de M. leprae. Em conjunto, esses resultados sugerem um importante envolvimento do receptor TLR-9 no processo inflamatório desencadeado no ENH abrindo perspectivas para novas abordagens imunoprofiláticas e terapêuticas / Mycobacterium leprae
,
etiological
agent of leprosy, expresses
in abundance a
cationic protein similar to histones, called
histone
-
like protein (
Hlp
)
, present
in
the envelope as
well as
in bacterial nucleoid.
The r
ecognitio
n of bacterial DNA
rich in unmethylated CpG motifs by
TLR
-
9
is an important pathway for activation
of the innate immune response, which can lead to the elimination of the
infectious agent or mediate pathological manifestations. Moreover,
studies
showed tha
t DNA
-
histone complexes are mor
e potent agonists of TLR
-
9
than
DNA alone
.
This study aimed to investigate th
e involvement of TLR
-
9
in the
activation of the host immune response d
urin
g the course of
M. leprae
infection.
Initially, we analyzed the participat
ion of TLR
-
9 activation
on
the innate immune
response in
A549
alveolar epithelial cells after stimulation with
M. leprae
.
It was
shown
that
M. leprae
was able to induce
the chemokines
I
L
-
8 and MCP
-
1
, and
gene transcription of
antimicrobial peptide H
D
-
2
in
epithelial cells.
T
he
increase of CD80
expression on the cell surface
was also observed after
stimulation with bacillus.
Soluble mycobacterial
CpG
-
Hlp complex also induced
an increase in IL
-
8 in A549 cells. It was observed that the increase of IL
-
8
,
induc
ed by
M. leprae
,
occurs dependently
nuclear
translocation of NF
-
B and
synthetic TLR
-
9 antagonist affected IL
-
8 secretion induced by
M. leprae
.
T
he
addition of CpG to
wild
type
M. smegmatis
, but not to the mutant gene hlp
,
increased IL
-
8 production by epit
helial cells.
A
s a whole
, t
he
se
results
suggest
that respiratory epithelial cells can recognize
M. leprae
via TLR
-
9 and thus
participate in the innate immune response in the initial infection site.
Since the
appearance of erythema nodosum leprosum (ENL) is
associated with the
massive release of mycobacterial antigens
, it
was investigated the involvement
of TLR
-
9 in the pathogenesis of ENL.
In this sense, we observed an increase
in
expression of TLR
-
9, both
in
skin lesions
and
peripher
al mononuclear cells of
ENL
patients,
when compa
red with non
reactional
patients. Subsequently, we
measured the levels of TLR
-
9 ligands in the circulation of patients.
In addition
to
M. leprae
DNA
, high levels of Hlp were detected i
n the seru
m of
ENL
patients
.
As
TLR
-
9 also recog
nize
s
endogenous DNA, circulating levels of the human
DNA
-
histone complex were quantified
,
and we also observed an increase of
these complexes in
the
serum
of
ENL
patients. Furthermor
e, PBMCs from
ENL
pa
tients
secreted elevated levels of TNF
-
, IL
-
6 and IL
-
1
cytokines
in
response to CpG
-
Hlp complex
, when
compared to nonreactional
patients and
healthy individuals. F
inally, synthetic antagonist
of
TLR
-
9 inhibited the secretion
of cytokines by P
BMCs in respo
nse to
M. leprae
lysates
. The results described
in t
he second part of the study suggest a major involvement of TLR
-
9 receptor
in the inflammatory process triggered in ENL
,
opening up prospects for new
immunoprophylactic and therapeutic approaches.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13630 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Dias, André Alves |
| Contributors | Pinheiro, Roberta Olmo, Bozza, Fernando Augusto, Bellio, Maria, Moraes, Milton Ozório, Pereira, Verônica Schmitz, Pessolani, Maria Cristina Vidal |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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