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Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / INTRODUÇÃO. A interleucina 7 (IL-7) é uma citocina pleiotrópica produzida
principalmente por células estromais da medula óssea, células epiteliais tímicas e
intestinais. IL-7 e que promove o desenvolvimento de linfócitos T e B e diferenciação de
células T memória, especialmente CD4+. Por isso, diversos autores têm estudado a
capacidade de IL-7 promover a restauração da população de linfócitos em situações de
linfopenia e resposta imune de memória. Cães que desenvolvem leishmaniose visceral e
recebem tratamento especfico apresentam cura clínica. No entanto, após a interrupção do
tratamento, a maioria dos animais exibe recaída da doença, mesmo na ausência de reinfecção.
É possível que esse fenômeno esteja associado a uma dificuldade de
estabelecimento de linfócitos T de memória específicos para Leishmania em cães. Em
nosso laboratório, tentativas prévias foram realizadas para produzir a IL-7 canina em
Escherichia coli, no entanto, o rendimento da proteína biologicamente ativa foi pequeno.
OBJETIVO. Por isso, resolveu-se avaliar a viabilidade de produzir IL-7 do sistema
baculovírus-células de inseto. MATERIAL E MÉTODOS. No presente trabalho, uma
construção de DNA foi concebida contendo uma sequência de nucleotídeos que
codificam o peptídeo sinal da proteína GP64 do baculovírus da Autographa californica
(AcMNPV), a IL-7 canina (proteína madura) com códons otimizados para a tradução em
Trichoplusia ni, um espaçador com 23 aminoácidos e uma cauda de seis histidinas. A
construção de DNA elaborada foi sintetizada quimicamente, inserida em um plasmídeo
de clonagem (pUC57-GP64caIL-7), subclonada em um plasmídeo carreador (pFastBac1-
GP64caIL-7), adequado para o sistema baculovirus-célula de inseto, e transferida para o
cromossoma artificial do baculovírus recombinante (bacmídeo). RESULTADOS. A
produção de IL-7 recombinante canina (rcaIL-7) em células de inseto infectadas com
baculovírus recombinante foi otimizada. Em seguida, a rcaIL-7 foi produzida em células
High-five cultivadas em suspensão utilizando multiplicidade de infecção (MOI) de 5 e
tempo de infecção (TOI) de 48 h. A proteína recombinantes foi purificada por
cromatografia de afinidade em Sepharose-níquel, obtendo-se um rendimento médio de
5,5 mg por litro de cultivo. CONCLUSÃO. RcaIL-7 purificada, avaliada a 40 ng/mL,
mostrou-se capaz de promover a proliferação de células mononucleares de sangue
periférico de cães sadios, sem estímulo prévio ou concomitante, indicando que a proteína
foi produzida biologicamente ativa. Futuros estudos serão realizados para avaliar a
capacidade imunomoduladora da rcaIL-7 em cães e determinar a utilidade dessa citocinas
no tratamento de enfermidades caninas, como por exemplo, na leishmaniose visceral
canina. / INTRODUCTION. The interleukin 7 is a pleiotropic cytokine produced mainly by bone
marrow stromal cells, thymus and intestinal epithelial cells. IL-7 promotes the
development of T and B limphocytes and differentiation T cells to memory cells,
especially T CD4+ cells. For these reasons, several authors have studied the ability of IL-
7 to promote restoration of the lymphocyte population in cases of lymphopenia and
memory imune responses. Dogs which develop visceral leishmaniasis and are treated with
specific drugs develop only transient clinical cure. After treatment withdrawal, most
animals show disease relapse, even in the absence of reinfection. One possible
explanation for the lack of control of the infection after treatment in dogs is a difficulty
to develop/maintain specific memory T cells. Therefore, it is possible that effective
treatments for canine visceral leishmaniasis be developed by manipulating the immune
system. Previously, in our laboratory, it was attemped to produce recombinant canine IL-
7 (rcaIL-7) in Escherichia coli, however there was a low yield of biologically active
protein. OBJECTIVE. In the current project, the baculovírus-insect cell system was
evaluated to produce rcaIL-7. MATERIAL AND METHODS. In this study, a
construction of DNA was designed to encode nucleotides of Autographa californica
GP64 signal peptide, canine IL-7 (mature protein) with optimized codons for
Trichoplusia ni, a 23-amino acid spacer and a six histidine tail. The DNA construct was
chemically synthesized, inserted into a cloning plasmid (pUC57-GP64caIL-7), subcloned
into a carrier plasmid (pFastBac1-GP64caIL-7), suited to the baculovirus-insect cell
expression system, and transfered to an artificial chromosome of the recombinant
baculovirus (bacmid). RESULTS. Recombinant protein expression was optimizatized,
then, the rcaIL-7 was produced in a cell culture in suspension using multiplicity of
infection (MOI) 5 and time of infection (TOI) 48 hours. Subsequently rcaIL-7 was
purified by Nickel Sepharose-Affinity chromatography, obtaining an average yield of 5.5
mg per liter of culture. CONCLUSION. The purified recombinant rcaIL-7 at 40 ng/mL
was able to induce prolifereation of peripheral blood mononuclear cells of heath adult
dog, suggesting it was biologically active. Given the results, the rcaIL-7 may be used in
further studies to assess its ability to modulate canine immune system, that would be
useful for the development immunotherapy
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/14250 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Oliveira, Bárbara Maria Nascimento de |
| Contributors | Pinheiro, Cristiane Gabborgine Melo de, Soares, Milena Botelho Pereira, Carvalho, Lucas Pedreira de, Silva, Luciano Kalabric, Oliveira, Geraldo Gileno de Sá |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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