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Previous issue date: 2008 / Cnpq - PDTIS/FIOCRUZ / Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Laboratório de Farmacologia Bioquímica e Celular. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose visceral é uma doença de alta mortalidade quando não tratada.
Aproximadamente 500.000 novos casos ocorrem todo ano, freqüentemente em países
pobres e em desenvolvimento. No Brasil, a leishmaniose visceral é causada pela
Leishmania chagasi, que é transmitida principalmente pelo inseto vetor Lutzomyia
longipalpis. Após 72 h de alimentação sanguínea num hospedeiro infectado, parasitas
procíclicos são vistos aderidos ao intestino do inseto via flagelo. Esta adesão é vital para a
evolução do ciclo de transmissão do parasita. Em vetores espécie–específicos foi proposto
um papel para um lipofosfogligano (LPG) de superfície de Leishmania na adesão, porém,
em vetores permissíveis, tem-se sugerido que esta adesão seja independente de LPG.
Com o interesse de identificar e caracterizar moléculas que possam ter uma
participação na interação parasito-vetor, nós iniciamos o estudo de duas moléculas de L.
chagasi denominadas Flag e Sup, pertencentes à família de proteínas pequenas miristiladas
(SMP’s), que anteriormente haviam sido implicadas em adesão ao tubo digestivo de
flebotomíneos.
Amplificamos e seqüenciamos o gene Flag de L. chagasi e observamos por
alinhamento múltiplo o alto grau de conservação deste gene entre as espécies de
Leishmania. Proteínas Flag e Sup recombinantes foram produzidas e utilizadas para
produção de anticorpos policlonais em coelhos. Vimos por Western Blot de extrato protéico
de várias espécies de Leishmania, que os anticorpos monoclonal e policlonal anti-Flag/MBP
e o anticorpo policlonal anti-Sup, reconhecem as proteínas em todas as espécies,
evidenciando a conservação destas.
A
imunolocalização
destas
proteínas
mostrou
que
a
proteína
Flag
está
preferencialmente localizada na forma promastigota na bolsa flagelar e no flagelo, e, em
amastigota, na bolsa flagelar e no flagelo interno curto, enquanto que a proteína Sup
mostrou localização em toda a superfície do corpo em ambas as formas.
Experimentos de RT-PCR mostraram que há transcrição diferencial de Flag e Sup
quando comparamos entre as formas evolutivas amastigotas e promastigotas. Flag tem uma
expressão parecida nas duas formas evolutivas enquanto Sup é mais expresso em
amastigotas.
Ensaios de inibição ex-vivo incubando previamente L. chagasi com anticorpo
monoclonal anti-Flag ou policlonal anti-Sup, mostrou redução significativa de parasitas
aderidos ao intestino de L. longipalpis
Na tentativa de identificar um potencial receptor para o parasita no intestino de L.
longipalpis, observamos a marcação de uma proteína de 27 kDa no extrato protéico do vetor
utilizando parasita biotinilado em experimentos de “ligand blot”. / Visceral leishmaniasis is an illness of high mortality if not treated. Approximately
500,000 new cases occur per year, frequently in poor countries. In Brazil, visceral
leishmaniasis is caused by Leishmania chagasi, transmitted by the insect vector Lutzomyia
longipalpis. After 72h of blood feeding in an infected host, procyclic parasites are seen
adhered to insect gut by the flagellum. This adhesion is vital for the completion of the
parasite cycle of transmission. In species-specific vectors a role for a surface
lipophosphoglycan (LPG) of Leishmania in the adhesion has been considered, while in the
permissible vectors, this adhesion may be independent of LPG.
Aiming to identify and characterize molecules that may be involved in the parasite-
vector interaction, we initiated a study of two molecules of L. chagasi, Flag and Sup, which
belong to the small myristylated protein family (SMP's), that have previously been implicated
in adhesion to the sandfly midgut.
We amplifyed and sequenced the Flag gene of L. chagasi and, using multiple
alignments, observed a high degree of conservation of this gene among Leishmania species.
Recombinant protein Flag and Sup were produced and used for polyclonal antibodies
production in rabbits. By Western Blot of total protein extract of some species of Leishmania,
we observed that the anti-Flag monoclonal and polyclonal antibodies and the anti-Sup
polyclonal antibody, recognized proteins in all the analyzed species, evidencing their
conservation.
Immunolocalization of these proteins showed that Flag is preferentially located in the
flagellar pocket and flagellum in the promastigote form and in the flagellar pocket and
internalized short flagellum in the amastigote, while Sup showed localization on the cell
surface in both forms.
Experiments of RT-PCR showed that there is a differential transcription of Flag and
Sup between amastigotes and promastigotes. Flag has similar levels of expression in both
evolutive forms while Sup is more expressed in amastigotes.
Assays of ex-vivo inhibition with L. chagasi previously incubated with monoclonal
antibodies anti-Flag or anti-Sup showed a significant reduction of the number of adhered
parasites to the L. longipalpis midgut.
In an attempt to identify a potential receptor for the parasite in the intestine of L.
longipalpis, we observed the labelling of a protein of 27 kDa in the protein extract of the
vector using biotinylated parasites in experiments of "ligand blot".
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/5658 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Lobo, Amanda Revoredo |
| Contributors | Levy, Claudia Masini D’Avila, Silva Neto, Mário Alberto Cardoso da, Machado, Ednildo de Alcântara, Traub-Cseko, Yara Maria |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Amanda Revoredo Lobo, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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