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Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As Leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero
Leishmania, que afetam indivíduos em aproximadamente 88 países. Atualmente, a medida de
controle da doença mais aceita é o desenvolvimento de uma vacina profilática; porém, para
que uma vacina efetiva seja alcançada, torna-se necessário a compreensão dos fatores que
regulam e participam na proteção durante e após a infecção natural. São comuns trabalhos em
que a resposta imune do tipo Th1 é medida exclusivamente pela produção in vitro de IFN-γ,
porém a avaliação de um só parâmetro nem sempre é suficiente para predizer proteção. O
presente trabalho visou estudar a qualidade de resposta Th1 induzida por diferentes antígenos
de Leishmania em pacientes com a forma cutânea de leishmaniose tegumentar americana
(LTA) provenientes do RJ. Utilizando-se ensaios de citometria de fluxo multiparamétrica para
marcadores de superfície, e para as citocinas IL-2, TNF-α e IFN-γ, bem como ELISA para
IFN-γ, foram feitas comparações da resposta induzida pelos extratos totais de promastigotas
de fase estacionária de L. (V.) braziliensis (LbT) e L. (L.) amazonensis (PH8T), assim como
frações enriquecidas em componentes subcelulares de L. (L.) amazonensis, em células
mononucleares de sangue periférico de pacientes com LTA, antes e 140 dias após o
tratamento, e indivíduos controles sadios. A análise das subpopulações de linfócitos T por
citometria de fluxo não identificou alterações significativas nos percentuais de células CD8 +,
CD4+ e CD25+ induzidas pelos diferentes estímulos, dentro de um mesmo grupo, nem entre os
grupos de pacientes e controles. A avaliação individual da MFI integrada (frequência de
células produtoras de uma citocina multiplicada pela intensidade média de fluorescência) para
cada citocina estudada, não evidenciou nenhuma diferença marcante na resposta imune do
tipo Th1 induzida pelos diferentes estímulos; porém, através da avaliação da contribuição dos
fenótipos CD4+ produtores de 3, 2 ou 1 única citocina na resposta imune do tipo Th1 total,
observamos diferenças qualitativas bem distintas entre as respostas obtidas antes e após o
tratamento, e entre os antígenos estudados. Todos os estímulos apresentaram aumento da
porporção de células multifuncionais nos pacientes PT, em relação aos AT. Após o
tratamento, LbT foi o estímulo que induziu maior proporção de células multifuncionais
(produtoras de IL-2, TNF-α e IFN-γ, simultaneamente; 28%), seguido da fração de membrana
de L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), enquanto que, PH8T induziu a menor proporção de
células multifuncionais (10%), e a maior proporção de células simples produtoras de IFN-γ
(38%). Corroborando alguns outros relatos da literatura, observamos que as células
multifuncionais são as que possuem a maior intensidade média de fluorescência para as 3
citocinas estudadas. A avaliação quantitativa da produção de IFN-γ por ELISA, demonstrou
que LbT foi o estímulo que induziu significativamente a maior produção desta citocina, em
comparação aos demais estímulos, tanto antes como após o tratamento. Este último resultado
parece se correlacionar com os dados de citometria já mencionados, em que este mesmo
estímulo foi capaz de induzir o maior percentual de células T multifuncionais, células essas
com a capacidade de produzir uma quantidade maior de citocinas, do que os outros fenótipos
estudados, como evidenciado nos resultados de MFI. Nossos resultados levam a discussão
sobre a importância da avaliação da qualidade de uma resposta imune do tipo Th1 medida por
mais de um parâmetro, a nível de uma única célula, e sugerem que a avaliação das células
multifuncionais é importante para correlacionar com a cura da doença. / Leishmaniasis is a group of disease caused by different species of protozoan parasites from
the genus Leishmania, that affects 88 countries around the world. Currently, the most
accepted approach to control the disease is a prophylactic vaccine. However, to develop such
a vaccine, it becomes necessary to understand the factors that regulate and participate in the
healing process as well as protection during and after natural infection. It is well established
that Th1-immune response is important for the protection against intracellular parasites.
Many studies evaluate this response only by the in vitro IFN-γ production, but the evaluation
of this single parameter not always is sufficient to predict protection. The present work
assessed the quality of the Th1-immune response induced by different Leishmania antigens in
patients affected with the cutaneous form of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL)
from Rio de Janeiro, Brazil. Using multiparametric flow cytometry to access surface markers
and cytokines, such as IL-2, TNF-α and IFN-γ, as well as ELISA to measure IFN-γ in culture
supernatants, we evaluated the immune responses induced by total antigens of stationary
phase promastigotes of L. (V.) braziliensis (LbT) and L. (L.) amazonensis (PH8T), as well as
subcellular components, composed of enriched fractions of L. (L.) amazonensis
promastigotes, in peripheral blood mononuclear cells of ATL patients, before and 140 days
after antimonial therapy, and healthy controls. Analysis of the T lymphocytes subpopulations
by flow cytometry did not show significant variations in the percentage of CD4+, CD8+ and
CD25+ cells induced by all different stimuli within the same group, or among the three
studied groups. The individual evaluation of integrated MFI (frequency x MFI) for each
cytokine assessed did not show any marked difference in the Th1-immune response induced
by the different stimuli; however, by assessing the contribution of the CD4+ phenotypes
producing 3, 2, or a single cytokine in the total Th1-immune response, we were able to
identify very interesting differences. In the group of patients analyzed after treatment, LbT
induced the highest proportion of multifunctional CD4+ T cells (producing IL-2, TNF-α and
IFN-γ, simultaneously; 28%), followed by the membrane fraction of L. (L.) amazonensis
(PH8M; 23%), whereas PH8T induced the lowest proportion of multifunctional CD4+ T cells
(10%) and the highest proportion of single positive-cells for IFN-γ (38%). Corroborating
previously published data, our results also showed that multifunctional CD4+T cells are those
with the highest mean fluorescence intensity for the three cytokines studied. The quantitative
evaluation of IFN-γ by ELISA showed that LbT significantly induced the higher production
of this cytokine, in comparison to the other stimuli, both before and after treatment. This last
result appears to show a relationship with our flow cytometry data, in which the same antigen
was able to induce the highest percentage of multifunctional T cells, coincidently the cells that
produced the larger amounts of cytokines, in comparison to the other CD4+ T cells
phenotypes, as observed by the MFI values. Our results support the actual discussion about
the importance of evaluating not only the quantity, but also the quality of a Th1-immune
response by more than one parameter at a single-cell level, and indicate the importance of
studying multifunctional CD4+ T cells in the cure of of ATL lesions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/5663 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Macedo, Amanda Beatriz Rodrigues Barreto de |
| Contributors | Almeida, Renato Porrozi de, Antas, Paulo Renato Zuquim, Silva, Andrea Alice, Luca, Paula Mello de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Amanda Beatriz Rodrigues Barreto de Macedo, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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