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Previous issue date: 2001 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Neisseria meningitidisdo grupo C é uma bactéria encapsulada causadora dediversas
doenças, está associada à altas taxas de mortalidade e portanto é de grande importância
para a saúde pública. Bio-Manguinhos está desenvolvendo uma vacina conjugada formada
pela ligação covalente do polissacarídeo capsular àanatoxina tetânica e esta vacina,
atualmente, está sendo avaliada em estudos clínicosde Fase II em crianças de 1 a 9 anos.
A quantificação de componentes livres como polissacarídeos e proteínas faz parte do
controle de processo de vacinas conjugadas e tem o objetivo de evitar o aparecimento de
reações adversas exacerbadas e/ou redução da imunogenicidade do componente vacinal.
A Organização Mundial de Saúde preconiza níveis máximos de proteína livre no conjugado
vacinal de 5%, mas não estabelece um limite máximo para o polissacarídeo livre para a
vacina conjugada contra o grupo C. Desta forma, o objetivo deste estudo foi desenvolver e
validar métodos de controle de qualidade adequados para separar e quantificar estes
componentes livres presentes na vacina meningocócica C conjugada brasileira, utilizando a
técnica de eletroforese capilar (EC). Para a separação da proteína livre foram comparados
os modos de eletroforese capilar de zona livre (CZE) e cromatografia eletrocinética micelar
(MEKC). Diferentes condições de migração da amostravariando-se parâmetros como pH,
temperatura, tensão, concentração do tampão, ciclodextrinas e de surfactante dodecil
sulfato de sódio (SDS) foram estudadas. Os resultados demonstraram que a melhor
separação do conjugado foi obtida por MEKC utilizando tampão tetraborato de sódio
(TBNa) 150 mM, 25 mM de SDS, 60°C, 30 kV e pH 9,3. Entretanto, nos modos de EC
estudados não foi possível obter a separação completa dos componentes, sendo
necessária a utilização de outro processo. Por outro lado, por CZE foi possível observar a
separação da proteína ativada da nativa, demonstrando a necessidade de otimização da
reação de ativação da proteína, a fim de aumentar orendimento da reação de conjugação.
A separação completa do açúcar livre presente no conjugado foi obtida empregando CZE
utilizando tampão TBNa 50 mM, 40°C, 30 kV e pH 10. Com as condições escolhidas foi
possível determinar o conteúdo de polissacarídeo livre nos lotes de conjugado e validar o
método proposto, que se mostrou linear na faixa de 0,047 a 0,164 mg/mL, apresentou efeito
matriz, 0,0154 mg/mL de limite de detecção e 0,0454mg/mL de limite de quantificação.
Após as etapas de validação, foram quantificados alguns lotes de conjugado e observou-se
um alto teor de açúcar livre nos lotes com longo período de estocagem a 4°C. Desse modo,
fez-se a avaliação de um lote recentemente produzido e obteve-se o valor de 19,08% de
polissacarídeo livre. A fim de estimar o tempo de estocagem máximo do conjugado foram
realizadas análises com 30, 60 e 90 dias de estocagem a 4°C. Os valores encontrados até
60 dias não foram significativamente diferentes dosdeterminados no tempo zero. No
entanto, com 90 dias de estocagem ocorreu uma modificação do perfil do conjugado que
impossibilitou a sua quantificação. A metodologia desenvolvida e validada será introduzida
no controle de qualidade do lote de conjugado que será submetido aos estudos clínicos de
Fase III e na rotina da vacina conjugada estudada. Além disto, o conhecimento adquirido
poderá ser empregado no controle de qualidade de outras vacinas conjugadas contra
bactérias encapsuladas de interesse epidemiológico no país. / Neisseria meningitidisgroup C is an encapsulated bacterium that causes several diseases
and is associated with high mortality rates becoming a serious public health problem. Bio-Manguinhos is developing a conjugate vaccine constituted by covalent attachment of
capsular polysaccharide to tetanus toxoid, which iscurrently being evaluated in Phase II
clinical studies in children between 1-9 years. Free components quantification is a vaccine
process control assay and intended to prevent exacerbated adverse reactions occurrence
and/or vaccine immunogenicity reduction. The World Health Organization recommends 5%
of free protein maximum level in the conjugate vaccine, but does not set a limit for the free
polysaccharide contents. Thus, the aim of this study was to develop and validate quality
control methods appropriate to separate and quantify free components present in the
conjugate vaccine against N. meningitidisgroup C, using capillary electrophoresis (CE)
technique. For free protein separation, free capillary zone electrophoresis (CZE) and
micellar electrokinetic chromatography (MEKC) were compared and different sample
migration conditions were studied by varying parameters such as pH, temperature, voltage,
buffer concentration, cyclodextrin and surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS). The results
showed that the best separation was obtained by MEKC using sodium tetraborate buffer
(TBNA) 150 mM, 25 mM SDS, 60°C, 30 kV and pH 9.3. H owever, the CE did not induce a
complete separation of the components suggesting that other techniques should be
necessary. On the other hand, native and activated protein separation was possible using
CZE, demonstrating the necessity of optimize protein activation reaction in order to increase
the conjugation reaction yield. The total free sugar conjugate was completely separated
from the conjugate by CZE using 50 mM TBNA buffer, 40°C, 30 kV and pH 10. In these
conditions it was possible to determine the free polysaccharide content and validate the
proposed method, which was linear in 0.047 to 0.164 mg/mL range, showed a matrix effect,
0.0154 mg/mL of detection limit and 0.0454 mg/mL ofquantification limit.After the validation
steps, some conjugate batches were quantified and high levels of free sugar were observed
in batches storaged at 4°C for long periods. On the other hand a conjugate batch recently
produced was evaluated and showed19.08% of free polysaccharide. In order to estimate the
maximum storage time a conjugate batch was analyzed30, 60 and 90 days after the
production steps. The values found up to 60 days were not significantly different from that
one determined at the initial time. However, with 90 days of storage there was a change in
the conjugate profile that impaired its quantification. The methodology developed and
validated will be used to evaluate the conjugate batch that will be submitted to Phase III
clinical studies and in the routine quality controlof the conjugate vaccine. Moreover, the
acquiredknowledge could be used in quality control of other conjugate vaccines against
encapsulated bacteria of epidemiological importancein the country.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/5944 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Souza, Iaralice Medeiros de |
| Contributors | Bergeter, Eliana Barreto, Silva, Marco Antonio Mota da, Nascimento, Hilton Jorge do, Silveira, Ivna Alana Freitas Brasileiro da |
| Publisher | Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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