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Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A taxa de infecção por Trypanosoma cruzi em triatomíneos é um importante parâmetro
para a avaliação do risco de transmissão vetorial da doença de Chagas em localidades onde há
infestação doméstica e peridoméstica por estes insetos. A infecção por T. cruzi em insetos vetores
costuma ser avaliada pelo exame, através de microscopia óptica, de suspensões do conteúdo
intestinal fresco dos insetos, buscando-se nelas a presença de tripanossomatídeos flagelados. Esta
metodologia apresenta como desvantagens a necessidade de se transportar os insetos vivos até o
laboratório, além de não permitir a identificação da espécie de tripanossomatídeo presente nas
fezes dos triatomíneos. Técnicas de biologia molecular baseadas na reação em cadeia da
polimerase (PCR) têm, portanto, sido desenvolvidas para a identificação de T. cruzi em amostras
biológicas, como o conteúdo intestinal dos triatomíneos. O objetivo desta dissertação foi avaliar a
aplicabilidade e a sensibilidade de uma técnica de diagnóstico molecular da infecção natural por
T. cruzi, baseada na utilização de papel de filtro, em triatomíneos capturados no estado do Ceará.
Adicionalmente, procurou-se avaliar esta técnica diagnóstica em amostras do conteúdo intestinal
de triatomíneos criopreservadas em papel de filtro durante 11 anos. Foram estudados os conteúdos
intestinais de 68 espécimes de triatomíneos capturados no ano de 2000 (Rhodnius nasutus, n=40;
Triatoma pseudomaculata, n=25 e T. brasiliensis, n=3), além de fezes de 51 espécimes coletados
no ano de 2010 (T. pseudomaculata, n=15; T. brasiliensis, n=36). Os conteúdos intestinais obtidos
por compressão abdominal dos 119 triatomíneos foram analisados pelo exame direto por
microscopia óptica. As fezes foram diluídas sobre as lâminas de microscopia, em solução salina
tamponada, cobertas com lamínulas e examinadas no microscópico óptico com aumento de 400
vezes, para observação direta da presença de tripanossomatídeos. Alíquotas das suspensões fecais
foram separadas e aplicadas em tiras de papel de filtro (FTA Card, GE Healthcare,
Buckinghamshire, UK), que foram armazenadas individualmente em tubos de 2 mL e
acondicionadas em freezer a -20 ºC, para utilização na técnica de PCR, visando a detecção de
kDNA de T. cruzi. Empregaram-se os iniciadores S35 5´-
AAATAATGTACGGG(T/G)GAGATGCATGA-3`, e S36 5´-
GGTTGCATTGGGTTGGTGTAATATA-3`, que amplificam o fragmento de 330 pares de bases
contendo as regiões variáveis dos minicírculos do DNA do cinetoplasto (kDNA). O cálculo
comparativo das sensibilidades das técnicas diagnósticas (microscopia óptica e PCR) foi realizado
da seguinte forma: sensibilidade da técnica = número de exames positivos por esta técnica /
número de exames positivos em quaisquer das duas técnicas. Com relação à análise dos 68
conteúdos intestinais criopreservados em papel FTA Card, 58 foram positivos pela microscopia
óptica. Destes, 56 foram positivos pela PCR. Obteve-se, desta forma, uma sensibilidade
comparativa de 96,5% para a PCR e 100% para a microscopia óptica. Analisando-se as 51
amostras fecais recém-obtidas de triatomíneos, obteve-se uma positividade, pela microscopia
óptica, de quatro amostras e, pela PCR, de 14 amostras, obtendo-se uma sensibilidade de 100%
para a PCR e de 28.6% para a microscopia óptica. A concordância entre as técnicas foi de 66/68
(97%) para as amostras criopreservadas e de 41/51 (80,4%) para as amostras recém-obtidas de
insetos. Analisando-se as amostras em conjunto, obtivemos uma concordância de 107/119
(89,9%) entre as técnicas. O estudo conclui que a técnica de diagnóstico por PCR em amostras de
conteúdo intestinal de triatomíneos aplicadas ao papel FTA Card é aplicável para a estimativa das
taxas de infecção natural destes insetos pelo T. cruzi, sendo capaz de auxiliar a caracterização de
perfis eco-epidemiológicos e a detecção da circulação do parasita em ambientes silvestres,
peridomésticos e domésticos, contribuindo também para a avaliação do risco de transmissão da
doença de Chagas em localidades onde há infestação pelos vetores. / The rate of infection by Trypanosoma cruzi in triatomines is an important parameter for
assessing the risk of vectorial transmission of Chagas disease in localities where domestic and
peridomestic infestation by these insects are found. Infection with T. cruzi in triatomines is usually
evaluated by examining, by light microscopy, suspensions of intestinal contents of fresh insects,
seeking in them the presence of flagellate trypanosomatids. This approach has disadvantages as the
need to transport the live insects to the laboratory, and not allow the identification of the
trypanosomatid species present in the triatomine feces. Molecular biology techniques based on
polymerase chain reaction (PCR) have therefore been developed to identify T. cruzi in biological
samples, such as the intestinal contents of triatomines. The aim of this study was to evaluate the
applicability and sensitivity of the technique of molecular diagnosis of natural infection by T. cruzi,
based on the use of filter paper in triatomines captured in the Ceará state. Additionally, we sought to
evaluate this diagnostic technique in samples of intestinal content of triatomines cryopreserved on
filter paper for 11 years. We studied the intestinal contents of 68 specimens of insects captured in the
year 2000 (Rhodnius nasutus, n = 40; T. pseudomaculata, n = 25 and T. brasiliensis, n = 3), and feces
from 51 specimens collected in 2010 (T. pseudomaculata, n = 25; T. brasiliensis, n = 36). The
intestinal content obtained by abdominal compression of 119 insects were analyzed by direct
examination through optical microscopy. The feces were diluted on microscope slides in buffered
saline (pH = 7.0), covered with coverslips and examined under optical microscope with 400 times
magnification for direct observation of the trypanosomes presence. Aliquots of fecal suspensions were
separated and applied to strips of filter paper (FTA Card, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK),
which were stored individually in 2 mL tubes and stored at -20 ° C for use in PCR , aimed at detection
of kDNA of T. cruzi. The primers used were 5'-AAATAATGTACGGG S35 (T / G)
GAGATGCATGA-3 'and 5'-GGTTGCATTGGGTTGGTGTAATATA S36-3', which amplify a
fragment of 330 base pairs containing the hypervariable regions of the k-DNA minicircles. The
comparative calculation of the sensitivity of diagnostic techniques (optical microscopy and PCR) was
performed as follows: sensitivity = number of technical tests positive by this technique / number of
positive tests in any of the two techniques. Regarding the analysis of 68 cryopreserved paper intestinal
contents FTA Card, 58 were positive by light microscopy. Of these, 56 were positive by PCR. Was
obtained in this way, a comparative sensitivity of 96.5% for PCR and 100% for light
microscopy. Analyzing the newly obtained 51 fecal samples of insects, we obtained a positivity by
light microscopy, four samples and PCR of 14 samples, yielding a sensitivity of 100% for PCR and
28.6% for optical microscopy. The agreement between the techniques was 66/68 (97%) for the
cryopreserved samples and 41/51 (80.4%) for the newly obtained samples of insects. Analyzing the
samples together, we achieved an agreement of 107/119 (89.9%) between the techniques. The study
concludes that the technique of PCR for diagnosis in samples of intestinal content of triatomines
applied to FTA paper Card is applicable for estimating natural infection rates of these insects by
T. cruzi, is able to assist the characterization of eco-epidemiological profiles and the detection of the
parasite in the wild environment, peridomestic and domestic, also contributing to the assessment of
risk of transmission of Chagas disease in localities where there is infestation by vectors.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/6972 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Pinho, Irlane Faria de |
| Contributors | Lima, Marli Maria, Mallet, Jacenir Reis dos Santos, Oliveira, Fernanda Santos de, Costa, Filipe Anibal Carvalho, Pacheco, Raquel da Silva |
| Publisher | Instituto Oswaldo Cruz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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