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Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou / A identificação e caracterização dos mecanismos e moléculas envolvidos em
sinalização celular são essenciais para o entendimento da biologia parasitária do S. mansoni. Proteína quinases desempenham papel chave em vias de sinalização e tem sido propostas como potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas anti-Schistosoma. Visto que a caracterização funcional em S. mansoni é dificultada por limitações nos métodos de transformação genética deste parasito, o presente estudo propõe o uso de C. elegans como um modelo para a expressão heteróloga de genes de S. mansonique codificam proteínas quinases. Genes que codificam proteína quinases em S. mansoni, homólogos aos identificados em C. elegans, foram selecionados pelo nosso grupo a partir do proteoma do parasito através de uma abordagem filogenômica.
Inicialmente, foi selecionada a proteína quinase JNK, que participa da via de sinalização das MAP quinases para a realização das análises experimentais. Em C. elegans, a proteína JNK está relacionada ao aumento de longevidade e da resistência aos estresses térmico e oxidativo. Oligonucleotídeos específicos foram desenhados para amplificar a região promotora do gene em C. elegans bem como as regiões codificantes (CDS) em ambos os organismos. A região promotora foi amplificada a partir do DNA genômico extraído de C. elegans adultos. O RNA total foi extraído de esquistossômulos e C. elegans adultos. As CDS foram amplificadas a partir do cDNA sintetizado e os fragmentos de DNA resultantes foram clonados em E. coliDH5α. As construções obtidas foram digeridas com enzimas de restrição selecionadas de forma a linearizar o vetor contendo a região promotora e recuperar as CDS. Posteriormente, foram realizadas subclonagens através da ligação das CDS de C. elegans e S. mansoni com a
construção contendo a região promotora. C. elegans N2 receberam as construções
finais através de microinjeção. Foram obtidas três linhagens que expressam Ce_JNK-1, denominadas N2 Ex01[Ce_jnk-1], N2 Ex02[Ce_jnk-1]e N2 Ex03[Ce_jnk-1]e duas linhagens expressando Sm_JNK, denominadas N2 Ex04[Sm_jnk] e N2 Ex05[Sm_jnk].
Os níveis de expressão de Sm_JNK e Ce_JNK-1 nas linhagens transgênicas foram
avaliados por RT-PCR quantitativo. Apesar do aumento da expressão de JNK
observado nas linhagens transgênicas, não houve aumento na longevidade das
mesmas. Embora esta seja a primeira utilização de expressão heteróloga em C. elegans para investigar a função de genes de S. mansoni, esta técnica tem sido utilizada com sucesso para nematóides parasitos e pode tornar-se uma abordagem alternativa para os estudos funcionais em outros parasitos. / The identification and characterization ofmechanisms and molecules involved
in cell signaling are essential to the understanding of the S. mansoni parasite’s
biology. Protein kinases play key roles in signaling pathways and have been
proposed as potential targets for the development of new anti-schistosome drugs.
Since functional characterization in S. mansoni is hampered by limitations in methods for genetic transformation in this parasite, the present study proposes to use C. elegans as a model for heterologous expression of S. mansoni genes encoding
protein kinases. S. mansoniprotein kinase coding genes orthologous to those
identified in C. elegans were selected from the parasite’s proteome by using a
phylogenomic approach. Initially, the protein quinase JNK that participates in the
MAP kinases signaling pathwaywas selected to perform the experimental analyses.
In C. elegans, JNK is related to increased longevity and resistance to oxidative and
thermal stress. Specific primers were designed to amplify promoter regions of the
JNK gene in C. elegans as well as the protein coding regions (CDS) in both
organisms. The promoter region was amplified from the adult nematode’s DNA. Total
RNA was extracted from schistosomula and mature C. elegans. CDS were amplified
from synthesized cDNA and the resulting DNA fragments were cloned in E. coli DH5α. The construction obtained was digested with restriction enzymes to linearize
the vector containing the promoter region and recover the CDS. Subsequently,
subcloning was performed by ligation of C. elegansand S. mansoni CDS with the
final construct containing the promoter region. C. elegansN2 received the final
constructions through microinjections. Weobtained three lineages that expresses
Ce_JNK-1, named N2 Ex01[Ce_jnk-1], N2 Ex02[Ce_jnk-1]and N2 Ex03[Ce_jnk-1]
and two line ages that express Sm_JNK, named N2 Ex04[Sm_jnk] and N2 Ex05[Sm_jnk]. The expression levels of Ce_JNK-1 and Sm_JNK in transgenic lineages were measured by quantitative RT-PCR. Despite the increased expression of the JNK gene in the transgenic lineages, increased longevity was not observed in these organisms. Although this is the first use of heterologous expression in C. elegans to investigate gene functions in S. mansoni, it has been used successfully
for nematode parasites and may become an alternative approach to functional
studies in other parasites.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/7241 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Gava, Sandra Grossi |
| Contributors | Oliveira, Riva de Paula, Oliveira, Guilherme Corrêa, Caldeira, Roberta Lima, Andrade, Hélida Monteiro de, Silva, Carlos Eduardo Calzavara, Oliveira, Guilherme Corrêa |
| Publisher | s.n. |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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