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Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Relógios biológicos são mecanismos endógenos de marcar a passagem do tempo e podem ser encontrados em animais, plantas, fungos e até organismos unicelulares. No modelo Drosophila, o mecanismo molecular que controla os ritmos circadianos (~24 horas) funciona através de alças de retroalimentação negativa envolvendo alguns genes, sendo os principais: period, timeless, cycle e Clock. Os homólogos destes genes já foram encontrados em várias espécies de animais, apontando para uma origem ancestral comum. Mosquitos são vetores de diversos agentes causadores de doenças a humanos e animais, mas apesar da sua importância epidemiológica pouco se conhece sobre os mecanismos moleculares que controlam os ritmos de atividade e hematofagia neste grupo de insetos. O presente trabalho objetivou o estudo do relógio biológico circadiano em mosquitos, usando como modelos a espécie diurna Aedes aegypti e a noturna Culex quinquefasciatus
Os estudos moleculares foram sempre acompanhados de experimentos de monitoramento da atividade/repouso dos insetos. A primeira etapa da pesquisa compreendeu a obtenção em Ae. aegypti da seqüência codificante integral do gene homologo a timeless de Drosophila melanogaster e o estudo comparativo da seqüência do mesmo entre as duas espécies. Os resultados apontaram para uma alta similaridade em regiões de timeless conhecidas como importantes em Drosophila para manutenção do relógio biológico, sugerindo conservação de sua função nos mosquitos. A segunda etapa da pesquisa envolveu a determinação do padrão de expressão circadiana de period, timeless, cycle e Clock em mosquitos. Após estudos preliminares sobre a expressão de timeless e cycle em machos de Aedes aegypti, foram obtidas as curvas de expressão circadiana de period, timeless, cycle e Clock na cabeça de fêmeas de Ae. aegypti e Cx. quinquefasciatus
Os resultados sugerem que o relógio central funcione de forma muito semelhante nas duas espécies. Análise da expressão desses genes nos corpos decapitados das fêmeas de Ae. aegypti, entretanto, aponta para padrões diferentes de expressão em relação à cabeça. Foi analisado também o efeito da inseminação e da hematofagia na expressão dos genes de relógio em Ae. aegypti. Apesar de dados da literatura mostrarem que a inseminação e a alimentação com sangue (após inseminação), causam alteração no comportamento das fêmeas de mosquito, apenas a hematofagia parece exercer alteração significativa na expressão dos genes de relógio. Finalizando, foi efetuado o silenciamento de timeless em Ae. aegypti por técnica de RNA de interferência, através da injeção de RNA dupla-fita de timeless no tórax de fêmeas adultas. O silenciamento da expressão foi detectado tanto na cabeça quanto no corpo das fêmeas no quarto dia após a injeção do RNA dupla-fita, mesmo dia em que foi detectada alteração no padrão de comportamento. Esse resultado confirma o papel de timeless no controle da atividade em mosquitos / Biological clocks are endogenous time keepi
ng systems that can be
found in animals,
plants, fungi and even unicellular organisms. In the
Drosophila
model, the molecular
mechanism that controls the circadian rhythm
(~24 hours) works through negative feedback
loops composed of a number of genes, among which the principal genes are:
period, timeless
,
cycle
and
Clock.
The homologues of these genes have been found in many animal species and
their comparison points to a common ancestral
origin. Mosquitoes ar
e vectors of several
organisms and viruses that cause diseases in hu
mans and other animals, however despite their
epidemiological relevance not much is known about
the molecular mechanisms controlling their
activity rhythms and bloodfeedin
g behaviour. The purpose of
the present work was to
investigate the molecular regulati
on of the biological clock in mo
squitoes, using as models the
diurnal species
Aedes aegypti
and the nocturnal species
Culex quinquefasciatus
. Analysis of the
mosquitoes’ activity/rest behaviour was performed
in parallel to the molecular studies. The first
stage of this research was to obtain, in
Aedes aegypti
, the full coding sequence of the gene
homologue to the
timeless
gene of
Drosophila melanogaster
and to perform comparative
analysis between them. The results s
howed high similarities between the
timeless
gene of the
two species, mainly in regions known, in
Drosophila
, to have a crucial involvement in the
operation of the biological clock, thus sugg
esting function conservation of the gene in
mosquitoes. The second stage of the research
involved the determination of the patterns of
expression of the clock genes
period, timeless
,
cycle
and
Clock
in mosquitoes. After preliminary
studies of male
Ae. aegypti
, in which the temporal pattern of the expression of
timeless
and
cycle
was determined, the circadian expression of
period, timeless
,
cycle
and
Clock
was characterised
in the heads of females of the species
Ae. aegypti
and
Cx. quinquefasciatus
. The results suggest
that the central clock works in a very similar
way in both species. The expression of the same
four genes in the behead
ed bodies of females of
Ae. aegypti
, however, showed a pattern
different from that of the head. The effect
s of insemination and blood meal intake upon the
expression of clock genes in
Ae. aegypti
were also analysed. In spite of the data in the literature
showing that insemination drives important change
s in the behaviour of the female mosquito, in
this study only the intake of blood seemed to cau
se significant changes in
the expression of the
clock genes. To finalize the st
udy of the biological clock in
mosquitoes, silencing of the
timeless
gene in the head and body of
Ae. aegypti
mosquitoes was performed
using an interference RNA
technique in which the thoraxes of adult females were injected with
timeless
double-stranded
RNA. Silencing of gene expre
ssion was achieved on the fourth da
y after injection, the same day
in which a significant alteration of the activity pattern of these females was detected. This result
confirms the role of
timeless
in the control of activity
behaviour in mosquitoes
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/9108 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Cunha, Carla Gentile Rodrigues da |
| Contributors | Moreira, Luciano Andrade, Oliveira, Pedro Lagerblad de, Ehlers, Samira Chahad, Sorgine, Marcos Henrique, Lima, José Bento Pereira, Peixoto, Alexandre Afrânio |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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