LIMA, Bruno Bezerra. Efeitos das toxinas A e B do Clostridium difficile sobre a via de WNT/Beta-catenina em células epiteliais intestinais. 2014. 79 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-05-19T12:12:30Z
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Previous issue date: 2014 / Clostridium difficile toxins A and B (TcdA and TcdB) are homologous glycosyltransferases that inhibit a group of small GTPases within host cells, but several mechanisms underlying their pathogenic activity remain unclear. Here, we evaluated the effects of TcdA and TcdB on the Wnt/Beta-catenin pathway, the major driving force behind the proliferation of epithelial cells in colonic crypts. IEC-6 and RKO cells stimulated with Wnt3a-conditioned medium were incubated with 10, 50 and 100 ng/mL of TcdA or TcdB for 24h, resulting in a dose-dependent inhibition of the Wnt signaling, as demonstrated by a T-cell factor (TCF) reporter assay. This was further confirmed by immunofluorescence staining for nuclear localization of Beta-catenin and western blotting for Beta-catenin and c-Myc (encoded by a Wnt target gene). Moreover, our western blot analysis showed a decrease in the Beta-catenin protein levels, which was reversed by z-VAD-fmk, a pan-caspase inhibitor. Nonetheless, TcdA was still able to inhibit the Wnt/Beta-catenin pathway even in the presence of z-VAD-fmk, lithium chloride (a GSK3B inhibitor), or constitutively active Beta-catenin, as determined by a TCF reporter assay. Furthermore, pre-incubation of RKO cells with TcdA for 12h also attenuated Wnt3a-mediated activation of Wnt signaling, suggesting that inactivation of Rho GTPases plays a significant role in that inhibition. Taken together, these findings suggest that attenuation of the Wnt signaling by TcdA and TcdB is important for their anti-proliferative effects. / As toxinas A e B do Clostridium difficile (TcdA e TcdB) são glicosiltransferases homólogas que inibem um grupo de pequenas GTPases dentro da célula hospedeira, contudo, vários mecanismos envolvidos na atividade patogênica dessas toxinas permanecem desconhecidos. No presente estudo, avaliamos os efeitos das TcdA e TcdB na via de Wnt/Beta-catenina que representa a força motora principal responsável pela proliferação das células epiteliais nas criptas colônicas. Foram utilizadas células IEC-6 (células epiteliais de criptas de Rattus novergicus) e RKO (células de adenocarcinoma de cólon humano). Estas células foram estimuladas com meio condicionado contendo Wnt3a e incubadas com 10, 50 ou 100 ng/mL de TcdA ou 1, 5 ou 10 ng/mL de TcdB por 24h, resultando em uma inibição dose-dependente da via de sinalização canônica de Wnt, como demonstrado pelo ensaio de repórter de fator de célula T (TCF). Esse resultado foi corroborado pelos dados da imunofluorescência com marcação para a localização nuclear de Beta-catenina e por western blotting para Beta-catenina e c-MYC (gene-alvo da via de Wnt). Além disso, os dados do experimento de western blot evidenciaram uma diminuição dos níveis da proteína Beta-catenina, o qual foi prontamente revertido por z-VAD-fmk, um pan-inibidor de caspase. Entretanto, a TcdA ainda foi capaz de inibir a via de Wnt/Beta-catenina mesmo na presença do z-VAD-fmk, cloreto de lítio (um inibidor de GSK3Beta) ou plasmídeo de Beta-catenina constitutivamente ativo, como determinado pelo ensaio do TCF (TOPFlash/Luciferase). O estudo evidenciou ainda que a pré-incubação de células RKO com TcdA por 12h também atenuou a ativação da via de Wnt mediada por Wnt3a, o que sugere que a inativação de RhoGTPases, particularmente Rac1, possui um papel nessa inibição. Em conclusão, esses achados sugerem que a inibição da via canônica de Wnt pelas TcdA e TcdB representa um mecanismo importante da sua patogênese e explica seus efeitos anti-proliferativos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.repositorio.ufc.br:riufc/12264 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Lima, Bruno Bezerra |
| Contributors | Brito, Gerly Anne de Castro |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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