ALVES, Luis Antonio de Oliveira. Expressão e regulação da quinase celular intestinal (ICK) em modelo de desnutrição in vivo e in vitro. 2014. 144 f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-04T13:13:41Z
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Previous issue date: 2014 / Malnutrition can affect the intestinal architecture, causing mucosal atrophy and compromising epithelial turnover. Although the gut is able to compensatorily respond to malnutrition, the molecular mechanisms by which the gut responds to protein deprivation are not completely understood. The intestinal cell kinase (ICK) is a highly conserved serine/threonine protein and a novel component of the signaling pathways that regulate cell proliferation in the intestinal crypt. In order to evaluate the role of the intestinal compensatory response to protein deprivation mediated by ICK, the activation of molecular pathways related to cell proliferation and survival were measured in C57BL/6J mice subjected to low protein diet (containing 2% protein) for five days and received standard chow-fed controls. We analyzed the intestinal canonical Wnt/β-catenin pathway, mammalian target of rapamycin (mTOR), mitogen-activated protein kinase (MAPK) and protein kinase B (PKB/Akt) by immunoblotting. We also measured the expression of intestinal stem cells markers (LGR-5 and Bmi1). We also conducted an in vitro study using human ileocecal adenocarcinoma cells (HCT-8) starved with low serum (0-1%) to evaluate the ICK response with or without gut trophic factors, such as glutamine (2 mM), alanyl-glutamine (10 and 50mM), and zinc (10 and 50μM), casein and bovine serum albumin (BSA) at a concentration of 0.25 or 0.5% in the medium, respectively. We also assessed ICK mRNA transcript by q-PCR after protein deprivation. In order to evaluate the effect of this kinase on cell proliferation and apoptosis, the ICK gene was silenced using interference RNA in HCT-8 cells. Cell viability was measured by trypan blue exclusion. Furthermore, caspase 3 and 9, cleaved PARP, analyzed by western blot, and annexin V, measured by flow cytometry, were used to assess apoptosis. In order to measure ICK effect on cell proliferation, we analyzed Wnt/β-catenin and cyclin D1 pathways by western blot. We identified a significant and transient increase in ICK intestinal levels following low-protein induced malnutrition, concomitant with the activation of molecular pathways related to proliferation and survival, as well as increased expression of intestinal stem cell markers. This work also documented that the protein deprivation, induced by low serum concentration, increased the expression of ICK in HCT-8 cells, an effect that was reversed by BSA in the medium. This reverse effect was not seen with other compounds such as glutamine, alanyl-glutamine or zinc. Despite the increase in ICK expression after protein deprivation, no significant difference in its transcripts was found, when compared with controls. The silencing of the ICK gene significantly decreased Wnt/β-catenin and cyclin D1 signaling activation in HCT-8 cells with increased apoptosis by a caspase dependent mechanism. Our results suggest that the increased ICK expression in response to protein deprivation is a protective mechanism that limits cell apoptosis and supports epithelial cell proliferation following malnutrition. Keywords: Malnutrition. Protein deprivation. Intestinal cell kinase. β / A desnutrição pode afetar a arquitetura intestinal, causando atrofia da mucosa e comprometendo o turnover epitelial. Embora o intestino seja capaz de responder compensatoriamente à desnutrição, os mecanismos moleculares pelos quais o intestino responde à privação proteica não estão completamente esclarecidos. A quinase celular intestinal (ICK) é uma proteína altamente conservada do tipo serina/treonina e um novo componente das vias de sinalização que regulam a proliferação celular na cripta intestinal. Para avaliar o papel da resposta intestinal compensatória à privação proteica, regulada pela ICK, foi medida a ativação de vias moleculares relacionadas à proliferação e sobrevivência celulares, como a via canônica Wnt/β-catenina, a via da proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), vias da proteína-quinase ativada por mitógeno (MAPK) e da proteína quinase B (PKB/Akt), bem como a expressão de marcadores para células-tronco intestinais (LgR-5 e Bmi1) por imunoblotting num modelo in vivo em camundongos fêmeas C57BL/6J submetidas à uma dieta hipoproteica (contendo 2% de proteína) por cinco dias e controles nutridos recebendo dieta padrão. Também foi realizado um estudo in vitro utilizando células HCT-8 de adenocarcinoma ileocecal humano desafiadas com meio padrão com restrição de soro fetal bovino (0-1%) para avaliar a resposta da ICK na presença ou não de fatores tróficos intestinais como glutamina (2mM), alanil-glutamina (10 e 50 mM) e zinco (10 e 50μM), além de caseína e albumina sérica bovina (BSA) na concentração de 0,25 e 0,5% no meio, respectivamente. A análise de RNAm foi feita para avaliar o transcrito de ICK por q-PCR, após privação proteica. No intuito de avaliar o efeito dessa quinase sobre a proliferação celular e apoptose, foi realizado o silenciamento do gene da ICK com uso de RNA de interferência em células HCT-8. A viabilidade celular foi avaliada com base na exclusão do azul de tripan. Posteriormente, foram realizados testes de western blot para caspase 3 e 9, PARP-clivada, além de anexina V por citometria de fluxo para avaliar apoptose, assim como western blot para via Wnt/β-catenina e ciclina D1 no intuito de medir os mecanismos relacionados à proliferação celular. Dessa forma, foi identificado um aumento significativo e transitório nos níveis intestinais de ICK na desnutrição induzida pela ração hipoproteica, concomitante com a ativação de vias moleculares relacionadas à proliferação e sobrevivência, bem como o aumento da expressão de marcadores para células-tronco intestinais. Esse trabalho também documentou que a privação proteica, induzida por baixa concentração de soro, aumenta a expressão de ICK em células HCT-8, efeito que foi revertido pela adição de BSA no meio. O mesmo resultado, não foi observado com outros compostos como glutamina, alanil-glutamina e zinco. Apesar do aumento da expressão da ICK após privação proteica, não houve diferença significativa da sua transcrição quando comparado com os controles. O silenciamento do gene de ICK reduziu significativamente a sinalização da via Wnt-β-catenina e ciclina D1 em células HCT-8 com aumento da apoptose por um mecanismo dependente de caspases. Os resultados sugerem que o aumento da expressão de ICK em resposta à privação proteica é um mecanismo de proteção que limita a apoptose e suporta a proliferação celular epitelial na desnutrição.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.repositorio.ufc.br:riufc/15323 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Alves, Luis Antonio de Oliveira |
| Contributors | Guerrant, Richard Littleton, Fu, John Zheng, Oriá, Reinaldo Barreto |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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