CAVALCANTI, J. H. F. Caracterização da família multigênica da oxidase alternativa em plantas do gênero Medicago e avaliação da expressão em Medicago sativa sob condições de estresse. 2011. 75 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2015-01-05T20:09:02Z
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Previous issue date: 2011 / In plants, Alternative Oxidase (AOX) is enconded by small milti gene family located in genomc DNA. This multi gene family was studied in mono and dicots plants being clusterd in two subfamilies: Aox1 and Aox2. Aox1 gene are found in all angiosperms táxon presenting gene expression related to stress situations while Aox2 genes are found in dicots plants only and presenting a houkeeping expression. Many Aox1 genes e just one Aox2 are found in the most of dicots studied. However, in Fabales, as cowpea and soybean, is found a profile with two genes Aox2 (Aox2a , Aox2b) and one Aox1 gene. In this work was characterized a multi gene family of Aox genes in Medicago genus (Medicago truncatula e Medicago sativa) belonging to Fabales Order. Data mining in genBanks characterized four Aox genes (Aox1, Aox2a, Aox2b1 and Aox2b2) in Medicago truncatula genome revealing for first time a duplication of Aox2b genes. Specifics primers designed for each Aox gene and then were used to amplification by PCR, cloning and partial sequencing of these genes in Medicago sativa. Gene expression was carried out by semiquantitative RT-PCR in: germination seeds (0, 24, 48 hours of germination), roots and leaves from Medicago sativa grewth in Hoaglend’s medium and applied to disticts stress conditions (0, 6, 12 e 24 hs after treatment): control, salicylic acid (0,5mM), PEG (100g/L), H2O2 (10mM) e cisteíne (0,5mM). The results revealed that all four Aox genes were detected in seed of Medicago sativa. However, Aox1, Aox2b1 and Aox2b2 genes presented high expression during germination while Aox2a showed constitutive expression. In leaves, Aox1, Aox2a and Aox2b1 were detected in all conditions tested, but Aox2b2 was observed more strong in stress situations only. Simirily observed in germination, Aox1, Aox2b1 and Aox2b2 increased transcripts levels in response to all stress conditions. Aox2a, one more time, had constitutive, but very strong expression. In roots, all genes were detected and a similar induction profile of Aox1, Aox2b1 and Aox2b2 were confirmed less to PEG treatment where just Aox1 was responsive. Aox2a had constitutive expression too, but it was weakly expressed. In order to understand the co-expresion of Aox1, Aox2b1 and Aox2b2 genes, the promoter regions were cloned and sequenced revealing close motifs among them suggesting th involviment of cis-elements in their regulation. Theses resuls corroborate with co-expression stress-induced of Aox1/Aox2b found in cowpea. However, in Medicago sativa, it was observed tissue-specific exression. Aox1, Aox2a and Aox2b1 with characteristics constitutive and induced in seeds germination and roots tissue while in leaves Aox2b2 differed by present stress-induced expression only. / Oxidase Alternativa (AOX) em plantas é codificada por uma pequena família multigênica de origem nuclear (DNA genômico). Essa família multigênica foi bem estudada em mono e dicotiledôneas sendo subdividida em duas subfamílias: Aox1 e Aox2. Os genes Aox1 são encontrados em mono e eudicotiledôneas apresentando expressão mais relacionada a condições de estresses enquanto que os genes Aox2 são encontrados apenas em eudicotiledôneas com expressão constitutiva. Vários genes Aox1 e apenas hum gene Aox2 são encontrados na maioria das eudicotiledôneas estudadas. Nesse trabalho, caracterizou-se a família multigênica da Aox no gênero Medicago (Medicago truncatula e Medicago sativa) pertencente à ordem Fabales. Em Medicago truncatula, a família multigênica da Aox foi carcterizada através de busca por bioinformática em bancos de dados identificando-se 4 genes Aox (Aox1, Aox2a, Aox2b1 e Aox2b2) no genoma dessa espécie revelando pela primeira vez uma duplicação do gene Aox2b. Oligonucleotídeos específicos desenhados para cada um dos genes foram usados para amplificação por PCR, clonagem e seqüenciamento parcial dos referidos genes em Medicago sativa. A expressão gênica foi estudada, através de RT-PCR semiquantitativa, em sementes durante a germinação (0, 24 e 48 horas de após embebição) e em raízes e folhas de Medicago sativa crescidas em meio hidropônico de Hoagland e submetidas a diferentes condições de estresse (0, 6, 12 e 24 hs após tratamento): controle, ácido salicílico (0,5 mM), PEG (100 g/L), H2O2 (10 mM) e cisteína (0,5 mM). Os resultados revelaram que todos os 4 genes Aox foram detectados em sementes de Medicago sativa, entretanto os genes Aox1, 2b1 e 2b2 apresentaram aumento da expressão durante a germinação enquanto que o Aox2a mostrou-se constitutivo. Em folhas os genes Aox1, 2a e 2b1 foram detectados em todas as condições testadas já o Aox2b2 foi detectado mais intensamente apenas nas condições de estresse. De maneira semelhante ao observado durante a germinação os genes Aox1, 2b1 e 2b2 tiveram expressão aumentada em resposta a todas as condições de estresse. O Aox2a mostrou-se constitutivo, mas foi intensamente expresso. Em raízes, todos os genes foram detectados e um perfil semelhante de indução dos genes Aox1, 2b1 e 2b2 também foi observado com exceção do tratamento com PEG onde apenas Aox1 foi induzido. O Aox2a também se mostrou constitutivo, mas foi fracamente expresso. Com a finalidade de se compreender melhor a co-expressão dos genes Aox1, 2b1 e 2b2 em Medicago sativa os promotores foram clonados e seqüenciados revelando regiões idênticas entre eles indicando o envolvimento de elementos cis comuns na regulação. Esses resultados corroboram com a co-expressão induzida por estresse de Aox1/Aox2b observada anteriormente em feijão. Contudo, em Medicago sativa, observamos expressão diferencial entre tecidos: no tecido radicular os genes Aox1, Aox2a e 2b1 podem sem induzidos por estresses e/ou mostram uma característica de expressão. Por outro lado, em folhas o gene Aox2b2 diferenciou por apresentar apenas característica de gene induzido em condições de estresse.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.repositorio.ufc.br:riufc/15658 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Cavalcanti, João Henrique Frota |
| Contributors | Costa , José Hélio |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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