CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Pterocarpans represented the largest isoflavonoid class after isoflavones and recent studies have revealed that representatives of this group can act on specific targets of mitosis. This study evaluated the potential cytotoxic , genotoxic and mutagenic of the CP001 in tumoral and normal human cell lines. The inhibitory effect in Eg5 kinesin and quantum biochemistry calculation has been peformed as well. Cytotoxicity tests showed that CP001 had significant effect on the tested tumoral lines (HL-60, HCT-116, OVCAR-8, SF-295) with IC50 ranging between 0.2 and 3.61 ÂM. Effect confirmed by kinetic growth curve in real time, where the CP001 inhibit growth of OVCAR-8 cell line at a concentration of 4 uM , similar to paclitaxel (0.5 mM). Thus, in order to determine the mechanism of action involved a sequence of in vitro experiments were performed. The assessment of nuclear DNA content was measured in OVCAR-8 cells to examine the effect of pterocarpan on the cell cycle phases , showing that CP001 is capable to arrest cell cycle at the G2/M phase, concentration of 5 uM , and potentiating effect when added in combination with paclitaxel. The cell cycle arrest in G2/M phase may be related to action of the compound on tubulin. The tubulin assay polymerization was conducted and revealed that CP001 has polymerization rate (Vmax = 80.95 mOD / min ) below paclitaxel (Vmax = 100 mOD / min) and close to monastrol ( Vmax = 88.46 mOD / min). These data suggest that interference with tubulin polymerization is not as significant as that shown in paclitaxel. Specific action mitosis proteins was another possibility tested. In confocal microscopy images it was possible to see multipolar arrangement for the segregation of chromosomes. Peforming western bloting it was observed Eg5 inhibition and cleaved PARP expression, suggesting cell death activation. These data was supported by quantum biochemistry calculation through docking and MFCC methodology which confirmed a very low bind energy between CP001-Eg5, -219.09 kcal/mol, increasing the odds of CP001 binding in the same site as monastrol. It was conducted study of chromosomal aberrations and it has not being observed clastogenic profile but aneugenic. The comet assay in mononuclear cells from human peripheral blood showed that the CP001 does not cause damage to the DNA. The CP001 has the potential cytotoxic activity against several tumor lines, arresting cell cycle in cell G2 / M phase and trigging cell death signals, the kinesin Eg5 being the target potential. These biological tests wereconfirmed by docking and MFCC tests. Genotoxic effects were insignificant, indicating that the drug may have minimal cytotoxic effects in non-transformed cells. / Pterocarpanos representam a maior classe de isoflavonÃides, depois das isoflavonas e estudos recentes tem revelado que os representantes deste grupo podem agir em alvos especÃficos da mitose. O presente estudo avaliou o potencial citotÃxico, genotÃxico e mutagÃnico, do composto CP001, em cÃlulas normais e linhagens tumorais humanas, alÃm do efeito inibitÃrio sobre a quinesina Eg5 fazendo uso de ensaios in vitro e com cÃlculos de bioquÃmica quÃntica. Os ensaios de citotoxicidade mostraram que o CP001 apresentou efeito significativo sobre as linhagens tumorais testadas (HL-60, HCT-116, OVCAR-8, SF-295) com IC50 variando entre 0,2 e 3,61 ÂM. Efeito confirmado na curva de crescimento cinÃtico em tempo real, onde o CP001 inibiu o crescimento da linhagem OVCAR-8 na concentraÃÃo de 4 ÂM, semelhante ao paclitaxel (0,5 ÂM). Desta forma, a fim de determinar o mecanismo de aÃÃo envolvido, uma sequÃncia de experimentos in vitro foram realizados. A avaliaÃÃo do conteÃdo de DNA nuclear foi mensurada em cÃlulas OVCAR-8, para analisar o efeito do pterocarpano sobre as fases do ciclo celular, revelando que o CP001 à capaz de parar o ciclo celular na fase G2/M, na concetraÃÃo de 5 ÂM, e com efeito potencializador, quando colocado em conjunto com o paclitaxel. A parada do ciclo celular na fase G2/M pode estar relacionado a aÃÃo do composto na tubulina. O ensaio da polimerizaÃÃo da tubulina foi conduzido e mostrou-se que o CP001 possui velocidade de polimerizaÃÃo (Vmax = 80.95 mOD/min), inferior a do paclitaxel (Vmax = 100 mDO/min) e prÃxima a do monastrol (Vmax = 88.46 mOD/min). Estes dados mostram que a interferÃncia na polimerizaÃÃo da tubulina nÃo à tÃo significativa quanto aquela apresentada no paclitaxel. A aÃÃo em proteÃnas especÃficas da mitose foi outra possibilidade testada. Imagens de microscopia confocal reveleu uma disposiÃÃo multipolar durante a segregaÃÃo dos cromossomos. O western bloting da quinesina Eg5 revelou que o CP001 inibe sua expressÃo assim como o monastrol, causando clivagem do PARP, que ativa o mecanismo de morte celular. Estes dados foram suportados por cÃlculos de bioquÃmica quÃntica, atravÃs de docking e MFCC, que confirmaram uma baixa energia de ligaÃÃo CP001-Eg5 de -219,09 Kcal/mol, o que aumenta a chance deste composto possuir esta quinesina como alvo especÃfico. Conduziu-se estudo de aberraÃÃes cromossÃmicas, nÃo sendo observado um perfil clastogÃnico, mas aneugÃnico. O teste genotÃxico do cometa em cÃlulas mononucleadas do sangue perifÃrico humano mostrou que o CP001 nÃo causa dano a fita do DNA. O CP001 possui potencial atividade citotÃxica contra vÃrias linhagens tumorais, parando o ciclo celular celular na fase G2/M e iniciando os sinais de morte celular, sendo a quinesina Eg5 o potencial alvo. Estes ensaios biolÃgicos foram confirmados por ensaios in silico de docking e MFCC. Os efeitos genotÃxicos em CMSPH foram insignificantes, indicando que a droga pode ter efeitos citotÃxicos mÃnimos em cÃlulas nÃo transformadas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:11249 |
| Date | 19 February 2016 |
| Creators | Assuero Silva Meira |
| Contributors | ClÃudia do à Pessoa, Manoel Odorico de Moraes Filho, Valder Nogueira Freire, Hernandes Faustino de Carvalho, Paulo Roberto Ribeiro Costa |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Farmacologia, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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