Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O cÃncer à um grande problema de saÃde e apresenta grande complexidade biolÃgica, tornando extremamente difÃcil o desenvolvimento de estratÃgias terapÃuticas eficazes para tratamento da doenÃa sobretudo em estados avanÃados. Os produtos naturais desempenham um papel relevante na farmacologia pela notÃria contribuiÃÃo para desenvolvimento de fÃrmacos como de ferramentas farmacolÃgicas. O sedimento marinho à uma fonte profÃcua de microrganismos produtores de metabÃlitos secundÃrios com propriedades biomÃdicas e os actinomicetos, bactÃrias Gram-positivas, sÃo excelentes produtores de compostos com diversas atividades biolÃgicas. Neste trabalho, o potencial farmacolÃgico da microbiota recuperada do sedimento marinho coletado no ArquipÃlago Fernando de Noronha foi investigado em cÃlulas tumorais em cultura. Dezesseis linhagens de actinomicetos foram isoladas, sendo que 7 renderam extratos brutos (EB) citotÃxicos (inibiÃÃo do crescimento > 75%) em cÃlulas de cÃncer colorretal humano HCT-116. Os valores de concentraÃÃo inibitÃria mÃdia (CI50) dos EBs variaram de 0,06 a 10 Âg/mL. A linhagem BRA-399, identificada como Streptomyces sp., apresentou a maior potÃncia (CI50 = 0,06 Âg/mL) e foi selecionada para prosseguir com a purificaÃÃo do princÃpio ativo e caracterizaÃÃo do efeito biolÃgico em cÃlulas tumorais. AtravÃs de um fracionamento quÃmico bioguiado com diferentes polaridades, isolou-se a Piericidina A1 (PA1), e outras molÃculas da mesma classe foram identificadas. A citotoxicidade da PA1 foi entÃo investigada em 2 linhagens tumorais, HCT-116 e em melanoma metastÃtico murino (B16-F10). Os ensaios do MTT, do SRB e de contagem de cÃlulas e integridade de membrana por citometria foram realizados com ambas linhagens celulares para se obter um perfil de inibiÃÃo da proliferaÃÃo celular causado pela PA1 apÃs 24, 48 e 72h. Os resultados mostraram inibiÃÃo da proliferaÃÃo celular em ambas linhagens nas concentraÃÃes mais altas testadas (entre 3,8 nM e 12 ÂM). Nas concentraÃÃes mais baixas (entre 0,1 aM e 24 pM) houve inibiÃÃo da proliferaÃÃo na linhagem HCT-116, mas nÃo em B16-F10. Apesar da potÃncia singular, as cÃlulas tinham a integridade da membrana preservada em quase todas as concentraÃÃes, exceto a maior de 12 ÂM. A PA1 à um bloqueador do complexo I da cadeia transportadora de elÃtrons e a alteraÃÃo do metabolismo energÃtico à uma caracterÃstica das cÃlulas tumorais envolvida com a agressividade do tumor. A partir destas observaÃÃes alguns experimentos foram realizados para avaliar a influÃncia da PA1 na induÃÃo de alteraÃÃes fenotÃpicas associadas à agressividade nas duas linhagens tumorais utilizadas (HCT-116 e B16-F10) na concentraÃÃo de 500 fM. As cÃlulas prÃ-tratadas com PA1 apresentaram aumento da CI50 frente ao tratamento com o quimioterÃpico doxorrubicina. O tratamento com PA1 tambÃm aumentou a taxa de migraÃÃo celular em B16-F10, bem como induziu alteraÃÃes morfolÃgicas compatÃveis com cÃlulas com maior atividade migratÃria, reforÃando a hipÃtese de que a alteraÃÃo causada pela PA1 no metabolismo da cÃlula tumoral pode induzir alteraÃÃo no fenÃtipo destas. / Cancer is a major health problem and presents great biological complexity, making it extremely difficult to develop effective therapeutic strategies to treatment of the disease, especially in advanced stages. Natural products play an important role in pharmacology because of the notorious contribution to the development of drugs as pharmacological tools. The marine sediment is a profitable source of microorganisms that produce secondary metabolites with biomedical properties, and the actinomycetes, Gram-positive bacteria, are excellent producers of compounds with diverse biological activities. In this work, the pharmacological potential of the microbiota recovered from the marine sediment collected in Fernando de Noronha Archipelago was investigated in tumor cells in culture. Sixteen actinomycete lineages were isolated, 7 of which yielded cytotoxic crude extracts (inhibition of growth > 75%) in human colorectal cancer cells HCT-116. The mean inhibitory concentration (IC50) values of the crude extracts varied from 0.06 to 10g/mL. The BRA-399 strain, identified as Streptomyces sp., presented the highest potency (IC50 = 0.06g/mL) and was selected to proceed with the purification of the active principle and characterization of the biological effect in tumor cells. Through a bioguided chemical fractionation, Piericidin A1 (PA1) was isolated, and other molecules of the same class were identified. The cytotoxicity of PA1 was then investigated in 2 tumoral lineages, HCT-116 and in murine metastatic melanoma (B16-F10). The MTT, SRB, cell count and membrane integrity by cytometry assays were performed with both cell lines to obtain a cell proliferation inhibition profile caused by PA1 at 24, 48 and 72h. The results showed cell proliferation inhibition in both lineages at the highest tested concentrations (between 3.8nM and 12M). Lower concentrations (0.1 to 24pM) inhibited proliferation in HCT-116 cells, but not in B16-F10 cells. Despite the unique potency, cells had the membrane integrity preserved at almost all concentrations, except the greater, 12M. PA1 blocks the complex I of the electron transport chain, and the change in the energy metabolism is a hallmark of tumor cells involved in tumor agressiveness. From these observations, some experiments were carried out to evaluate the influence of PA1 on the agressiveness of tumor cells (HCT-116 and B16-F10) in the concentration of 500fM. Cells pretreated with PA1 showed an increase in IC50 compared to treatment with the chemotherapeutic doxorubicin. Treatment with PA1 also increased the cell migration rate in B16-F10, as well as induced morphological alterations compatible with greater migratory activity cells, reinforcing the hypothesis that the alteration caused by PA1 in the tumor cell metabolism may induce alteration in their phenotype.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:11993 |
| Date | 30 January 2017 |
| Creators | Katharine Gurgel Dias FlorÃncio |
| Contributors | Diego Veras Wilke, Roberto CÃsar Pereira Lima JÃnior, GlÃucia Maria Machado Santelli |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Farmacologia, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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