Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As plantas medicinais tÃm se mostrado promissoras como fonte de novos fÃrmacos para modular a resposta inflamatÃria, incluindo a dor inflamatÃria. Pilocarpus microphyllus, conhecida popularmente como jaborandi, à uma espÃcie nativa do Nordeste e amplamente explorada pela indÃstria farmoquÃmica para a extraÃÃo da pilocarpina, um alcaloide imidazÃlico colinÃrgico. Suas folhas tambÃm possuem outros alcaloides, como epiisopilosina (EPIL) e epiisopiloturina (EPIT), obtidos de resÃduo industrial. Estudos preliminares determinaram a aÃÃo anti-inflamatÃria e antinociceptiva da epiisopiloturina em camundongos. Diante do exposto, o objetivo do presente estudo foi investigar o potencial anti-inflamatÃrio e antinociceptivo dos alcaloides EPIT e EPIL com determinaÃÃo do possÃvel mecanismo de aÃÃo. Para tanto, foram empregados modelos experimentais de inflamaÃÃo em neutrÃfilos humanos, hiperalgesia mecÃnica induzida por carragenina em camundongos (Von Frey eletrÃnico) e estudo in silico. Na avaliaÃÃo do potencial anti-inflamatÃrio, foi observado que tanto EPIT quanto EPIL (1â100 μg/mL) inibiram a degranulaÃÃo de neutrÃfilos (5x106 cÃlulas/mL) determinada pela liberaÃÃo de mieloperoxidase (MPO) induzida por PMA 0,1μM (CI40 = 14,3 e 29,5 μg/mL, respectivamente) ou fMLP 1μM (CI40 = 45,2 e 62,3 μg/mL, respectivamente). Esse efeito mostrou-se relacionado com a modulaÃÃo do metabolismo oxidativo, no qual EPIT e EPIL inibiram em atà 44 e 74%, respectivamente, a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROs) determinada por quimioluminescÃncia â sonda luminol. Ademais foi observado que EPIT e EPIL tambÃm reduziram o influxo de Ca2+ na cÃlula em 46 e 55%, respectivamente e inibiram a fosforilaÃÃo do NF-κB citosÃlico, impedindo assim sua translocaÃÃo para o nÃcleo. Destaca-se que as aÃÃes anti-inflamatÃria e antioxidante de EPIT e EPIL ocorreram sem afetar a viabilidade celular (teste do MTT e atividade da enzima lactato desidrogenase). No estudo da atividade antinociceptiva, EPIT e EPIL (0,3 e 1 mg/kg, i.p.) inibiram a hipernocicepÃÃo inflamatÃria induzida por carragenina (300 Âg/pata) em camundongos e reduziram significativamente os nÃveis de MPO em atà 87 e 74%, respectivamente, uma medida indireta da migraÃÃo neutrofÃlica. O prÃ-tratamento dos camundongos com EPIT (1 mg/kg, i.p.) e EPIL (0,3 mg/kg, i.p.) reduziu a expressÃo de COX-2 em tecido subplantar induzida por carragenina em camundongos. EPIT e EPIL estabeleceram fortes interaÃÃes com resÃduos de aminoÃcidos considerados essenciais para a ligaÃÃo com as isoformas COX-1 e COX-2. Os resultados obtidos sugerem que a atividade anti-inflamatÃria e antinociceptiva dos alcaloides imidazÃlicos, EPIT e EPIL, està relacionada, pelo menos em parte, a uma modulaÃÃo na ativaÃÃo e no acÃmulo de cÃlulas do sistema imune inato (neutrÃfilos) no foco inflamatÃrio, possivelmente por reduÃÃo do influxo de cÃlcio intracelular, ativaÃÃo do NF-кB e expressÃo de COX-2. / Medicinal plants have been shown to be promising as a source of alternative therapies to modulate the inflammatory response, including inflammatory pain. Pilocarpus microphyllus, popularly known as jaborandi, is a species native to the Northeast and widely exploited by the pharmochemical industry for the extraction of pilocarpine, a cholinergic imidazole alkaloid. Its leaves also have other alkaloids, such as epiisopilosine (EPIL) and epiisopiloturine (EPIT), obtained from industrial waste. Preliminary studies determined the anti-inflammatory and antinociceptive action of epiisopiloturine in mice. On the above, the aim of the present study was to investigate the anti-inflammatory and antinociceptive potential of the alkaloids EPIT and EPIL. For this, experimental models of inflammation in human neutrophils, mechanical hyperalgesia induced by carrageenan in mice (Von Frey electronic) and in silico study were used. In assessing the anti-inflammatory potential, both EPIT as EPIL (1 - 100 μg/mL) inhibited neutrophils degranulation (5 x 106 cells/mL) measured by myeloperoxidase activity in activated neutrophils by 1 μM fMLP (CI40 = 45.2 and 62.3 μg / mL, respectively) or 0.1 μM PMA (CI40 = 14.3 and 29.5 μg / mL, respectively). This effect was related to the modulation of the oxidative metabolism, in which EPIT and EPIL inhibited up to 44 and 74%, respectively, the production of reactive oxygen species (ROS) determined by chemiluminescence - luminol probe. In addition, it was observed that EPIT and EPIL also reduced the Ca2+ influx in the cell by 46 and 55%, respectively, and inhibited the phosphorylation of the cytosolic NF-κB, thus preventing its translocation to the nucleus. It is noteworthy that the anti-inflammatory and antioxidant actions of EPIT and EPIL occurred without affecting cel viability (MTT test and lactate dehydrogenase enzyme activity). In the study of antinociceptive activity, EPIT and EPIL (0.3 and 1 mg / kg, i.p.) inhibited carrageenan-induced inflammatory hypernociception (300 μg / paw) in mice and significantly reduced MPO levels by up to 87 and 74%, respectively, an indirect measure of neutrophil migration. Pretreatment of mice with EPIT (1 mg / kg, i.p.) and EPIL (0.3 mg / kg, i.p.) reduced the expression of COX-2 in subplantar carrageenan-induced tissue in mice. EPIT and EPIL were able to establish strong interactions with amino acid residues considered essential for binding to the COX-1 and COX-2 isoforms. The results obtained suggest that the anti-inflammatory and antinociceptive activity of imidazole alkaloids, EPIT and EPIL, are related, at least in part, to a modulation in the activation and accumulation of the innate immune system cells (neutrophils) in inflammatory focus, possibly by reducing intracellular calcium influx, activation of NF-кB and COX-2 expression.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:11997 |
| Date | 07 February 2017 |
| Creators | Talita MagalhÃes Rocha |
| Contributors | Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal, Nylane Maria Nunes de Alencar, Adriana Rolim Campos Barros |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Farmacologia, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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