nÃo hà / A lesÃo renal aguda (LRA) à uma das mais importantes complicaÃÃes do envenenamento botrÃpico, sendo considerada uma das principais causas de morte nestes acidentes. A creatinina plasmÃtica vem sendo utilizada como biomarcador de injÃria renal hà mais de 90 anos, entretanto tem baixa sensibilidade e especificidade para a lesÃo renal aguda. A demanda por um teste capaz de detectar os estÃgios desta lesÃo tem estimulado a busca de novas ferramentas diagnÃsticas. Uma vez que cÃlulas tubulares epiteliais sÃo os principais alvos dos efeitos tÃxicos dos venenos, este trabalho avaliou as aÃÃes do veneno de Bothrops insulairs (BiVT) sobre a funÃÃo renal de camundongos, examinando o papel da proteÃna KIM-1 como biomarcador precoce de LRA. TambÃm foram avaliados os efeitos do BiVT apÃs incubaÃÃo com linhagens celulares renais de tÃbulos proximais de macaco e humana, LLC-MK2 e HK2, respectivamente; na ausÃncia e na presenÃa das enzimas fenantrolina e catalase. Camundongos Swiss machos pesando entre 25-30 g foram inoculados com o BiVT por via intramuscular (3,5 mg/Kg) e observados por 24 horas no modelo de gaiola metabÃlica. Urina, sangue e os rins dos animais foram coletados para anÃlise dos seguintes parÃmetros: nÃveis urinÃrio e sÃrico de creatinina, nÃvel urinÃrio da proteÃna KIM-1, anÃlise histolÃgica dos rins e avaliaÃÃo do equilÃbrio Ãxido-redutor no tecido renal. No estudo com cÃlulas tubulares renais foram avaliados a viabilidade celular, o perfil de morte celular atravÃs da marcaÃÃo com os marcadores anexina/7-AAD para avaliaÃÃo de necrose/apoptose, rodamina para avaliaÃÃo do potencial transmembrÃnico mitocondrial e DCF para avaliaÃÃo da produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROs). O BiVT promoveu um aumento da creatinina plasmÃtica, reduziu a taxa de filtraÃÃo glomerular e aumentou os nÃveis urinÃrios do biomarcador KIM-1. A anÃlise histolÃgica do tecido renal revelou tumefaÃÃo mesangial, degeneraÃÃo e tumefaÃÃo glomerulares, degeneraÃÃo hidrÃpica, tumefaÃÃo tubular e edema intersticial no cÃrtex renal dos animais tratados com o BiVT. Na medula foram visualizadas as seguintes alteraÃÃes: infiltraÃÃo de cÃlulas inflamatÃrias, pequenos vasos congestos, degeneraÃÃo tubular hidrÃpica com secreÃÃo da proteÃna Tamm-Hosrsfall; e no interstÃcio, presenÃa de cÃlulas inflamatÃrias. CÃlulas LLC-MK2 incubadas com o BiVT, tiveram reduÃÃo de viabilidade, com bloqueio parcial deste efeito na presenÃa da enzima catalase. Houve um aumento do nÃmero de cÃlulas marcadas com 7-AAD, efeito nÃo observado quando na presenÃa de fenantrolina ou catalase; entretanto, a fenantrolina promoveu um aumento no nÃmero de cÃlulas com dupla marcaÃÃo e a catalase, um aumento no nÃmero de cÃlulas nÃo-marcadas. O BiVT induziu perda de potencial transmembrÃnico mitocondrial que nÃo sofreu alteraÃÃo quando incubado com fenantrolina, mas apresentou reversÃo parcial deste efeito na presenÃa da catalase. Na presenÃa do BiVT foi vista uma reduÃÃo da viabilidade das cÃlulas HK2, efeito parcialmente bloqueado na presenÃa da fenantrolina ou catalase. Houve reduÃÃo do potencial transmembrÃnico mitocondrial, efeito exacerbado pela fenantrolina e parcialmente bloqueado pela catalase. TambÃm foi visto um aumento na produÃÃo de EROs, efeito parcialmente bloqueado na presenÃa de fenantrolina ou catalase. Esses dados sugerem toxicidade do BiVT sobre o tecido renal e cÃlulas tubulares proximais. / Acute kidney injury (AKI) is one of the most important complications of bothropic envenomation, being considered one of the main causes of death in these accidents. Plasma creatinine has been used as a renal injury biomarker for more than 90 years; however, it has low sensitivity and specificity for acute kidney injury. The demand for a test capable of detecting injury stages has stimulated the search for new diagnostic tools. As epithelial tubule cells are the main targets for the toxic effects of venoms, this study evaluated the actions of Bothrops insularis venom toxin (BinsV) on the renal function of mice by evaluating the role of the KIM-1 protein as an early AKI biomarker. The effects of BinsV were also evaluated after incubation with renal cell lines of proximal tubules of monkeys and humans, LLC-MK2 and HK2, respectively; in the absence and presence of phenanthroline and catalase enzymes. Male Swiss mice weighing between 25 and 30 g were inoculated with BinsV intramuscularly (3.5 mg / kg) and observed for 24 hours in the metabolic cage model. The animalsâ urine, blood, and kidneys were collected for analysis of the following parameters: urinary and serum levels of creatinine, urinary levels of the KIM-1 protein, histological analysis of the kidneys and oxidoreductive balance evaluation in renal tissue. In the renal tubular cell study, cell viability and cell death profile were evaluated for necrosis/apoptosis using annexin/7-AAD markers, whereas rhodamine was used for evaluation of mitochondrial transmembrane potential and dichlorofluorescein (DCF) for the evaluation of reactive oxygen species (ROS) production. BinsV promoted an increase in plasma creatinine, reduced glomerular filtration rate, and increased urinary levels of the biomarker KIM-1. Histological analysis of renal tissue disclosed mesangial swelling, glomerular degeneration and swelling, hydropic degeneration, tubular swelling, and interstitial edema in the renal cortex of animals treated with BinsV. In the medulla, the following alterations were identified: inflammatory cell infiltration, small congested vessels, hydropic tubular degeneration with Tamm-Horsfall protein (THP) secretion, as well as the presence of inflammatory cells in the interstitium. LLC-MK2 cells that were incubated with BinsV had viability reduction, with partial blocking of this effect in the presence of the catalase enzyme. There was an increase in the number of cells labeled with 7-AAD, an effect not observed in the presence of phenanthroline or catalase; however, phenanthroline promoted an increase in the number of cells with double labeling, whereas catalase caused an increase in the number of non-labeled cells. BinsV induced loss of mitochondrial transmembrane potential, which did not change when incubated with phenanthroline, whereas this effect was partially reversed in the presence of catalase. A reduction in the viability of HK2 cells was observed in the presence of BinsV, an effect that was partially blocked in the presence of phenanthroline or catalase. There was a reduction in the mitochondrial transmembrane potential, an effect exacerbated by phenanthroline and partially blocked by catalase. An increase in ROS production was also observed, an effect that was partially blocked in the presence of phenanthroline or catalase. These data suggest BinsV toxicity on renal tissue and proximal tubular cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:12291 |
| Date | 29 August 2016 |
| Creators | Rodrigo Tavares Dantas |
| Contributors | Alice Maria Costa Martins, IÃda Pereira de Souza, JanaÃna Serra Azul Monteiro Evangelista, Maria de Fatima Oliveira, Darcielle Bruna Dias Elias |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Farmacologia, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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