CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Clostridium difficile à a maior causa de colite associada ao uso de antibiÃticos,
com significante morbidade e mortalidade. Glutamina (Gln), um aminoÃcido nÃo-essencial, Ã
a maior fonte combustÃvel para a dinÃmica das cÃlulas intestinais. Alanil-glutamina (Ala-Gln)
à um dipeptÃdeo, altamente solÃvel e bem tolerado. O objetivo deste estudo foi analisar as
alteraÃÃes induzidas pela toxina A (TcdA) do Clostridium difficile na morfologia e elementos
do citoesqueleto das cÃlulas epiteliais intestinais e o efeito do tratamento com Gln e Ala-Gln,
utilizando tÃcnicas avanÃadas de microscopia. Placas de cultura de cÃlulas com doze poÃos,
previamente acrescidas de lamÃnulas de vidro, com diÃmetro de 13mm, IEC-6, 5x105 foram
semeadas e cultivadas por 24 horas em meio DMEM. Depois, as cÃlulas foram incubadas por
24h de acordo com os seguintes grupos: Controle, TcdA (10 ng / mL), TcdA + Gln (10 mM)
e TcdA + Ala-Gln (10 mM). As cÃlulas foram fixados em formol a 4% por 14h, depois foram
examinados na microscopia de forÃa atÃmica (AFM), microscopia eletrÃnica de varredura
(SEM), microscopia confocal e fluorescente. Para o SEM as amostras foram fixadas em porta
amostras fita adesiva de carbono e cobertos com uma pelÃcula de ouro 15 mm para adquirir
condutividade por pulverizaÃÃo catÃdica. Para microscopia de fluorescÃncia e o confocal, as
cÃlulas foram permeabilizadas com PBS/Triton depois foram marcados com RhoA- FITC,
Faloidina âRodamina e DAPI e as imagens capturadas atravÃs de um microscÃpio invertido
de fluorescÃncia ou confocal. Um immunoblotting foi realizado com os mesmos grupos. A
membrana PVDF foi incubada com o anticorpo RhoA overnight, em seguida ativado pelo kit
Amershan. O controle protÃico foi feito por α-tubulina. TambÃm realizarmos experimentos de
proliferaÃÃo celular e estresse oxidativo. Observou-se que a TcdA causa intenso encolhimento
celular restando mÃltiplas extensÃes filamentosas. Esta alteraÃÃo na forma foi associada ao
colapso do citoesqueleto de F-actina demonstrada na microscopia de fluorescÃncia. Um
aumento da produÃÃo RhoA foi detectada no grupo tratado com Gln e Ala-Gln.
Demonstramos que a morfologia das cÃlulas intestinais e organizaÃÃo do citoesqueleto foram
dramaticamente alteradas pela TcdA e que a suplementaÃÃo com Ala-Gln e Gln impediu o
dano celular epitelial intestinal induzida pela TcdA provavelmente por aumentar a expressÃo
RhoA. A TcdA induziu uma reduÃÃo de 8,4% na proliferaÃÃo celular, enquanto o Ala-Gln e
Gln aumentou 13,2% e 12,7%, respectivamente. A TcdA induziu as cÃlulas ao dano
oxidativo, que foi revertido com o uso de Gln e Ala-Gln. Nossos resultados fornecem
justificativa para o uso potencial de Ala-Gln e Gln como terapia adjuvante na doenÃa causada
pelo Clostridium difficile. InvestigaÃÃo de alteraÃÃes morfolÃgicas e citoesqueleto usando
avanÃadas tÃcnicas de microscopia pode auxiliar na avaliaÃÃo da atividade de proteÃÃo ou
terapÃutica de drogas contra os efeitos TcdA. / Clostridium difficile is the major cause of antibiotic-associated colitis, a disease
with significant morbidity and mortality. Glutamine (Gln), a non-essential aminoacid, is a
major fuel for the dynamic intestinal cell population. Alanyl-glutamine (Ala-Gln) is a
dipeptide that is highly soluble and well tolerated. The aim of this study was to analyze the
changes induced by Clostridium difficile toxin A (TcdA) in intestinal epithelial cell
morphology and cytoskeletal element and the effect of Gln and Ala-Gln treatment, using
advanced microscopic techniques. Twelve well cell culture plates, with 13 mm diameter glass
coverlids, were seeded with 5x105 IEC-6 cells and grown for 24h in DMEM media.
Afterwards, the wells were incubated for 24h as follow: control, TcdA (10 ng/mL), TcdA +
Gln (10 mM) and TcdA + Ala-Gln (10 mM). The cells were than fixed in 4% formaldehyde
for 14 h and afterwards they were examined by atomic force microscopy (AFM), scanning
electronic microscopy (SEM) and Fluorescent microscopy. For the SEM the samples were
fixed to samples holders with carbon adhesive tape and covered with a 15 mm gold film for
conductivity by sputter. To fluorescent microscopy the cells were permeabilizided with
PBS/Triton after that they were marked with stained with FITC-RhoA, Rodhamine-phallodin
and DAPI performed using an inverted fluorescence microscope. An immunoblotting was
realized with the same groups. The PVDF membrane was incubated with RhoA antibody
overnight and afterwards activated by Amershan kit. The proteic control was made by α-
tubulin. Also performed experiments of cellular proliferation and oxidative stress. As
observed by AFM, SEM and Fluorescent microscopy TcdA caused intense cell shrinkage
with multiple extensions. This change in shape was associated with collapse of the F-actin
cytoskeleton demonstrated by fluorescent microscopy. An increase of RhoA production was
detected in the groups treated with Gln e Ala-Gln. We demonstrated that TcdA dramatically
altered the intestinal cell morphology and cytoskeleton organization and that Ala-Gln and Gln
supplementation consistently prevented the intestinal epithelial cell damage induced by TcdA
probably by increasing RhoA expression. The TcdA induced a reduction of 8.4% in cell
proliferation while the Ala-Gln and Gln increased by 13.2% and 12.7%, respectively. The
TcdA induced cells to oxidative damage, which was reversed by the use of Gln and Ala-Gln..
Our findings provide rationale for the potential use of Ala-Gln and Gln as adjuvant therapy in
Clostridium difficile disease. Investigation of morphological and cytoskeleton changes using
advanced microscopic techniques may aid in the evaluation of the protective or therapeutic
activity of drugs against TcdA effects.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:5955 |
| Date | 29 November 2011 |
| Creators | Ana AngÃlica Queiroz AssunÃÃo Santos |
| Contributors | Gerly Anne de Castro Brito, Geanne Matos de Andrade |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em CiÃncias MÃdicas, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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