CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Melioidosis is a potentially fatal disease caused by the bacterium Burkholderia
pseudomallei, considered emerging in Brazil since the first cases were reported in 2003, on
State of CearÃ. This study aimed to perform the molecular identification of 31 isolates of B.
pseudomallei (26 clinical and 5 environmental) maintained in the culture collection of CEMM
(Specialized Center for Medical Mycology), based on sequences 16S and 16S-23S rRNA. The
DNA of these samples was extracted with the kit Wizard  Genomic DNA Purification
(Promega), quantified by spectrophotometry and stored at 4ÂC. The amplification of a
fragment of 302 bp of 16S-23S rRNA specific to B. pseudomallei was performed by PCR
reaction with primers Bp1 and Bp4. The sequencing of 16S and 16S-23S rRNA was
performed by using of the kit DYEnamicTM ET terminators cycle sequencing (GE Healthcare).
The phylogenetic tree of 16S rRNA and the sequence identity matrix and sequence difference
count matrix based on the 16S-23S rRNA were generated by the program MEGA4, version
4.1. The results confirmed the identification of 15 strains of B. pseudomallei (5 clinical and 10
environmental), which represents 48.4% of the isolates analyzed in this study. The
phylogenetic tree based on 16S rRNA shows that the clinical and environmental isolates of B.
pseudomallei of State of Cearà are evolutionarily clustered with the strains B. pseudomallei
MSHR346 (Australia), B. pseudomallei 1106a (Thailand), B. pseudomallei K96243
(Thailand), B. pseudomallei 1710b (Thailand) and B. pseudomallei 668 (Australia). Using the
same extraction kit was possible to extract DNA from B. pseudomallei directly from clinical
specimen (bronchoalveolar lavage), confirming a new case of melioidosis in Ubajara/CE. In
this study, the use of PCR for amplification of a fragment of 302 bp of 16S-23S rRNA
identified correctly B. pseudomallei, and to confirm the discrimination between B.
pseudomallei and B. mallei, the sequencing of the 16S and 16S-23S rRNA genes was
performed. The technique of PCR coupled with sequencing of 16S and 16S-23S rRNA
resulted in a high sensitivity and specificity of detection of B. pseudomallei in this study. / A melioidose à uma doenÃa potencialmente fatal causada pela bactÃria Burkholderia
pseudomallei, sendo considerada emergente no Brasil desde que os primeiros casos foram
reportados em 2003, no Estado do CearÃ. Este estudo pretendeu realizar a identificaÃÃo
molecular de 31 isolados de B. pseudomallei (cinco clÃnicos e 26 ambientais) mantidos na
coleÃÃo de culturas do CEMM (Centro Especializado em Micologia MÃdica), com base nas
sequÃncias 16S e 16S-23S DNAr. O DNA destas amostras foi extraÃdo com o kit WizardÂ
Genomic DNA Purification (Promega), quantificado por espectrofotometria e armazenado a
4ÂC. A amplificaÃÃo de um fragmento de 302 pb da regiÃo espaÃadora 16S-23S DNAr
especÃfico para B. pseudomallei foi realizada por meio de reaÃÃo de PCR com os primers Bp1
e Bp4. O sequenciamento das regiÃes 16S e 16S-23S DNAr foi realizado pelo mÃtodo da
terminaÃÃo da cadeia pelo didesoxinucleotÃdeo, usando-se o kit DYEnamicTM ET terminators
cycle sequencing (GE Healthcare). A Ãrvore filogenÃtica da regiÃo 16S DNAr e as matrizes
sequÃncia identidade e contagem de diferenÃas baseadas na regiÃo 16S-23S DNAr foram
geradas pelo programa MEGA4, versÃo 4.1. Os resultados confirmaram a identificaÃÃo de 15
cepas de B. pseudomallei (cinco clÃnicas e dez ambientais), o que corresponde a 48.4% dos
isolados em estudo. A Ãrvore filogenÃtica baseada na regiÃo 16S DNAr demonstra que os
isolados clÃnicos e ambientais de B. pseudomallei do Estado do Cearà sÃo evolutivamente
agrupados com as cepas B. pseudomallei MSHR346 (AustrÃlia), B. pseudomallei 1106a
(TailÃndia), B. pseudomallei K96243 (TailÃndia), B. pseudomallei 1710b (TailÃndia) e B.
pseudomallei 668 (AustrÃlia). Com a utilizaÃÃo do mesmo kit de extraÃÃo tambÃm foi possÃvel
extrair DNA de B. pseudomallei diretamente de espÃcime clÃnico (lavado brÃnquico),
confirmando um novo caso de melioidose no MunicÃpio de Ubajara/CE. Em nosso estudo, o
uso da PCR para a amplificaÃÃo de um fragmento de 302 pb da regiÃo 16S-23S DNAr
identificou corretamente B. pseudomallei, sendo que para confirmar a discriminaÃÃo entre B.
pseudomallei e B. mallei, o sequenciamento das regiÃes 16S e 16S-23S DNAr foi realizado. A
tÃcnica de PCR aliada ao sequenciamento das regiÃes 16S e 16S-23S do DNA ribossÃmico
nuclear resultaram em uma elevada sensibilidade e especificidade de detecÃÃo de B.
pseudomallei neste estudo.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:6205 |
| Date | 14 September 2009 |
| Creators | Manuela Soares Couto |
| Contributors | Raimunda SÃmia Nogueira Brilhante, Marcos FÃbio Gadelha Rocha, Thalles Barbosa Grangeiro, Nilce Maria Martinez-Rossi |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em CiÃncias MÃdicas, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0027 seconds