A desnutriÃÃo pode afetar a arquitetura intestinal, causando atrofia da mucosa e comprometendo o turnover epitelial. Embora o intestino seja capaz de responder compensatoriamente à desnutriÃÃo, os mecanismos moleculares pelos quais o intestino responde à privaÃÃo proteica nÃo estÃo completamente esclarecidos. A quinase celular intestinal (ICK) à uma proteÃna altamente conservada do tipo serina/treonina e um novo componente das vias de sinalizaÃÃo que regulam a proliferaÃÃo celular na cripta intestinal. Para avaliar o papel da resposta intestinal compensatÃria à privaÃÃo proteica, regulada pela ICK, foi medida a ativaÃÃo de vias moleculares relacionadas à proliferaÃÃo e sobrevivÃncia celulares, como a via canÃnica Wnt/β-catenina, a via da proteÃna alvo da rapamicina em mamÃferos (mTOR), vias da proteÃna-quinase ativada por mitÃgeno (MAPK) e da proteÃna quinase B (PKB/Akt), bem como a expressÃo de marcadores para cÃlulas-tronco intestinais (LgR-5 e Bmi1) por imunoblotting num modelo in vivo em camundongos fÃmeas C57BL/6J submetidas à uma dieta hipoproteica (contendo 2% de proteÃna) por cinco dias e controles nutridos recebendo dieta padrÃo. TambÃm foi realizado um estudo in vitro utilizando cÃlulas HCT-8 de adenocarcinoma ileocecal humano desafiadas com meio padrÃo com restriÃÃo de soro fetal bovino (0-1%) para avaliar a resposta da ICK na presenÃa ou nÃo de fatores trÃficos intestinais como glutamina (2mM), alanil-glutamina (10 e 50 mM) e zinco (10 e 50μM), alÃm de caseÃna e albumina sÃrica bovina (BSA) na concentraÃÃo de 0,25 e 0,5% no meio, respectivamente. A anÃlise de RNAm foi feita para avaliar o transcrito de ICK por q-PCR, apÃs privaÃÃo proteica. No intuito de avaliar o efeito dessa quinase sobre a proliferaÃÃo celular e apoptose, foi realizado o silenciamento do gene da ICK com uso de RNA de interferÃncia em cÃlulas HCT-8. A viabilidade celular foi avaliada com base na exclusÃo do azul de tripan. Posteriormente, foram realizados testes de western blot para caspase 3 e 9, PARP-clivada, alÃm de anexina V por citometria de fluxo para avaliar apoptose, assim como western blot para via Wnt/β-catenina e ciclina D1 no intuito de medir os mecanismos relacionados à proliferaÃÃo celular. Dessa forma, foi identificado um aumento significativo e transitÃrio nos nÃveis intestinais de ICK na desnutriÃÃo induzida pela raÃÃo hipoproteica, concomitante com a ativaÃÃo de vias moleculares relacionadas à proliferaÃÃo e sobrevivÃncia, bem como o aumento da expressÃo de marcadores para cÃlulas-tronco intestinais. Esse trabalho tambÃm documentou que a
privaÃÃo proteica, induzida por baixa concentraÃÃo de soro, aumenta a expressÃo de ICK em cÃlulas HCT-8, efeito que foi revertido pela adiÃÃo de BSA no meio. O mesmo resultado, nÃo foi observado com outros compostos como glutamina, alanil-glutamina e zinco. Apesar do aumento da expressÃo da ICK apÃs privaÃÃo proteica, nÃo houve diferenÃa significativa da sua transcriÃÃo quando comparado com os controles. O silenciamento do gene de ICK reduziu significativamente a sinalizaÃÃo da via Wnt-β-catenina e ciclina D1 em cÃlulas HCT-8 com aumento da apoptose por um mecanismo dependente de caspases. Os resultados sugerem que o aumento da expressÃo de ICK em resposta à privaÃÃo proteica à um mecanismo de proteÃÃo que limita a apoptose e suporta a proliferaÃÃo celular epitelial na desnutriÃÃo. / Malnutrition can affect the intestinal architecture, causing mucosal atrophy and compromising epithelial turnover. Although the gut is able to compensatorily respond to malnutrition, the molecular mechanisms by which the gut responds to protein deprivation are not completely understood. The intestinal cell kinase (ICK) is a highly conserved serine/threonine protein and a novel component of the signaling pathways that regulate cell proliferation in the intestinal crypt. In order to evaluate the role of the intestinal compensatory response to protein deprivation mediated by ICK, the activation of molecular pathways related to cell proliferation and survival were measured in C57BL/6J mice subjected to low protein diet (containing 2% protein) for five days and received standard chow-fed controls. We analyzed the intestinal canonical Wnt/β-catenin pathway, mammalian target of rapamycin (mTOR), mitogen-activated protein kinase (MAPK) and protein kinase B (PKB/Akt) by immunoblotting. We also measured the expression of intestinal stem cells markers (LGR-5 and Bmi1). We also conducted an in vitro study using human ileocecal adenocarcinoma cells (HCT-8) starved with low serum (0-1%) to evaluate the ICK response with or without gut trophic factors, such as glutamine (2 mM), alanyl-glutamine (10 and 50mM), and zinc (10 and 50μM), casein and bovine serum albumin (BSA) at a concentration of 0.25 or 0.5% in the medium, respectively. We also assessed ICK mRNA transcript by q-PCR after protein deprivation. In order to evaluate the effect of this kinase on cell proliferation and apoptosis, the ICK gene was silenced using interference RNA in HCT-8 cells. Cell viability was measured by trypan blue exclusion. Furthermore, caspase 3 and 9, cleaved PARP, analyzed by western blot, and annexin V, measured by flow cytometry, were used to assess apoptosis. In order to measure ICK effect on cell proliferation, we analyzed Wnt/β-catenin and cyclin D1 pathways by western blot. We identified a significant and transient increase in ICK intestinal levels following low-protein induced malnutrition, concomitant with the activation of molecular pathways related to proliferation and survival, as well as increased expression of intestinal stem cell markers. This work also documented that the protein deprivation, induced by low serum concentration, increased the expression of ICK in HCT-8 cells, an effect that was reversed by BSA in the medium. This reverse effect was not seen with other compounds such as glutamine, alanyl-glutamine or zinc. Despite the increase in ICK expression after protein deprivation, no significant difference in its transcripts was
found, when compared with controls. The silencing of the ICK gene significantly decreased Wnt/β-catenin and cyclin D1 signaling activation in HCT-8 cells with increased apoptosis by a caspase dependent mechanism. Our results suggest that the increased ICK expression in response to protein deprivation is a protective mechanism that limits cell apoptosis and supports epithelial cell proliferation following malnutrition.
Keywords: Malnutrition. Protein deprivation. Intestinal cell kinase. β
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:8653 |
| Date | 11 September 2014 |
| Creators | Luis Antonio de Oliveira Alves |
| Contributors | Reinaldo Barreto OriÃ, Paulo Roberto LeitÃo de Vasconcelos |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em CiÃncias MÃdicas, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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