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Previous issue date: 2014 / The purinergic system can induce proliferation, differentiation and death on tumor cells. Different P2 purinergic receptors are involved in preventing the growth of these cells. Although the mechanisms are not completely known, they may represent interesting therapeutic targets to control tumors. The RT4 and T24 human tumor bladder cell lines have been used as low and high cancer malignancy phenotype models, respectively. Our research group has demonstrated that quercetin increases the ADP hydrolysis and inhibits ecto-5'-nucleotidase/ CD73, exerting an anti-proliferative effect on T24 cell lines. We also demonstrate that T24 cell lines expresses the purinergic enzymes CD39L4 and ecto-5'-nucleotidase / CD73, and have low hydrolytic activity of ATPase and ADPase in contrast to a high activity AMPase. These data suggest the involvement of the enzymes and purinergic receptors on progression the tumor of the bladder, as well as other tumor types.The objective of the present study was characterize the purinergic receptors P2X (1-7) expression profile on human bladder tumor cell lines and biopsies; and investigate the inflammatory genes that are up-regulated on high-grade human tumor bladder cells compared to low grade tumor bladder cells. Human bladder cells RT4 and T24 were obtained from the ATCC. Cells were cultured in DMEN and RPMI, respectively, supplemented with 10% of fetal bovine serum (FBS), under ideal conditions of cultivation Data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey–Kramer test. To confirm the relevance of P2X (1-7) receptors in bladder cancer, we have also assessed their expression in human biopsies. For this purpose, upon approval by the local ethics committee, specimens of bladder tumors and normal tissues were obtained from the same patients, who have been undergone surgical resection at the Hospital São Lucas/PUCRS. All samples were collected and rapidly frozen in -80ºC with RNA holder.Tissue specimens were ground and then sonicated in a TRIzol kit. The mRNA level was analyzed using RT-PCR analysis. Real-time PCR revealed that the mRNA expression of P2X purinergic receptors, particulary P2X4R was significantly up-regulated on both T24 and RT4 cell lines. Data from human bladder tumor biopsies comparing to bladder normal tissue, showed that P2X6 and P2X7 receptors appeared to be most often up-regulated on tumor tissues. Twelve inflammation related genes, CCL2, CCR2, TNF-α, MAPK3, IL-1β, IL-6, ADORA1, CD200, CD4, CHRNA4, EDNRA e ITGB2 were significantly up-regulated on the grade III bladder tumor cell line T24 when compared to grade I bladder tumor cell line RT4. Our results indicate that the inflammation genes overexpressed may play an important role in regulating urinary bladder cancer. We can conclude that P2X purinoreceptors and inflammation genes are differentially distributed among normal bladder, low and high tumor bladder, which could contribute to the different characteristics of these different types of cells. / O sistema purinérgico pode induzir a proliferação, diferenciação e morte em células tumorais. Diferentes receptores purinérgicos P2, estão envolvidos na inibição do crescimento tumoral. Embora os mecanismos não sejam completamente conhecidos, estes receptores podem representar alvos terapêuticos interessantes no tumor de bexiga. As linhagens celulares derivadas de tumor de bexiga humano RT4 e T24 têm sido usadas como modelo de baixa e alta malignidade de tumor, respectivamente. Estudos realizados pelo nosso grupo de pesquisa têm demonstrado o envolvimento do sistema purinérgico no tumor de bexiga. A quercetina aumenta a hidrólise do ADP e inibe a ecto - 5' - nucleotidase / CD73, exercendo um efeito anti - proliferativo sobre as células T24. Também demonstramos que as linhagens de células T24 expressam enzimas CD39L4 e ecto - 5' - nucleotidase / CD73, e têm baixa atividade hidrolítica de ATPase e ADPásica com uma elevada atividade AMPásica. Estes dados sugerem o envolvimento das enzimas e receptores purinérgicos na progressão do tumor de bexiga, bem como em outros tipos de tumor. O objetivo do estudo é caracterizar a expressão dos receptores purinérgicos P2X (1-7) em biópsias de câncer de bexiga e linhagens celulares de tumor de bexiga humano, relacionado com o perfil de genes inflamatórios mais expressos nestas amostras.Metodologia: As linhagens celulares de bexiga humanas RT4 e T24 foram obtidas a partir da ATCC. As células foram cultivadas em meio RPMI e DMEN, respectivamente, suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB), sob condições ideais de cultivo. Para confirmar a relevância dos receptores P2X (1-7) no tumor de bexiga, avaliou-se a expressão em biópsias humanas. Para isso, após aprovação pelo comitê de ética local, amostras de tecidos normais e tumorais de bexiga foram obtidas dos mesmos pacientes, submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital São Lucas / PUCRS. O RNA total dos tecidos foi isolado utilizando kit TRIzol . O nível de mRNA foi analisado utilizando análise RT - PCR .Resultados: O PCR em tempo real revelou que a expressão de mRNA de receptores purinérgicos P2X, particularmente P2X4R foi significativamente up- regulada em ambas linhagens RT4 e T24. Dados a partir de biópsias de tumores de bexiga humanos que comparam os resultados de expressão do tecido tumoral em relação ao tecido normal de bexiga, demonstrou que os receptores de P2X6 e P2X7 estão superexpressos em tecidos tumorais. Doze genes relacionados com a inflamação, CCL2, CCR2, TNF-α, MAPK3, IL-1β, IL-6, ADORA1, CD200, CD4, CHRNA4, EDNRA e ITGB2 foram significativamente superexpressos em células T24 derivadas de tumor de grau III quando comparadas com as células RT4 derivadas de tumor de grau I. Nossos resultados indicam que os genes superexpressos de inflamação podem desempenhar um papel importante na regulação do tumor de bexiga urinária. Conclusão: Podemos concluir que purinoreceptores P2X e os genes inflamatórios são diferencialmente distribuídos entre bexiga normal e tumoral, o que pode contribuir para as diferentes características destes diferentes tipos de tumores.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_PUC_RS:oai:meriva.pucrs.br:10923/5994 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Carvalho, Daniela de Oliveira |
| Contributors | Morrone, Fernanda Bueno |
| Publisher | Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da PUC_RS, instname:Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, instacron:PUC_RS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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