Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CHAPTER I -
Prostate cancer is a common disease in the world and in some countries it is one of the
main causes of male population mortality. Some molecular markers have been associated
with prostate carcinogenesis. To observe changes in transcript levels of the AR, SRD5A2,
KLK2, PSMA and PCA3 genes, the mRNA was analyzed in tissues with prostatic
adenocarcinoma (PCa, N= 48) and benign prostatic hyperplasia (BPH, N= 25), performed
through a differential multiplex RT-PCR assay. Significant differences were observed in
the relative expression of these genes between cancerous and non-cancerous tissues.
The optical density ratio of the cDNA amplicons between PCa and BPH for the AR gene
was 1.6-fold higher for the prostatic adenocarcinoma. On the other hand, the SRD5A2
mRNA levels were associated with BPH and were 1.4-fold higher than that of PCa. For
KLK2, PSMA and PCA3, the transcriptional levels were respectively, 1.9-, 1.9- and 5-fold
higher in PCa than those in BPH tissues. Of the diagnostics tests carried through
individually, the PCA3 gene was that presented higher sensitivity and accuracy, and the
inclusion of the serum PSA improved the sensitivity (of 76 to 92%), positive preditive value
(of 85 to 94%), negative preditive value (of 60 to 62%) and accuracy (of 74 to 78%). The
results suggest that the higher AR, KLK2, PSMA, and PCA3 and/or reduced SRD5A2
genes expression in prostatic tissues may indicate the occurrence of prostate
adenocarcinoma; however the PCA3 and serum PSA analysis together are highly
promising as auxiliary method in the diagnosis of this cancer.
CHAPTER II -
Purpose: Prostate cancer (PCa) is the most commonly diagnosed malignancy in men, and
it consists of multifactorial and multifocal events. Due to the complexity of the disease
process, which includes genome alterations, local invasion, micrometastatic cell
extravasations to circulation, invasion of secondary organ tissues, and resistance to
hormonal blockage, many markers must be used to represent the multiple and variable
events that lead to cancer development. The low specificity of the unique serum marker
for prostate cancer diagnostics, PSA, has leaded us to investigate four potential markers
in the peripheral blood of patients by detecting their mRNA levels and associating them to
clinical parameters. Methods: The expression levels of the KLK2, KLK3, PCA3 and PSMA
transcripts were determined by Nested RT-PCR. Patients with PCa (99) and with benign
prostatic hyperplasia (BPH, 36), and healthy volunteers (104) were investigated. Results:
Significant differences for the RNA relative levels have been found for the KLK2, PCA3
and PSMA transcripts between PCa and BPH patients or healthy volunteers. The KLK2
and PSMA levels also presented a positive association (P<0.05) with extra-prostatic
disease (pT3). The combined positive RT-PCR Nested for the KLK2, PCA3, PSMA genes
with serum PSA higher than 4ng/mL presented a 10-fold higher chance of cancer
occurrence than healthy controls, with sensitivity, specificity and positive predictive value
of 57%, 89% and 93%, respectively. Conclusions: The combined analysis of KLK2, PCA3
and PSMA transcripts may become a useful tool for the discrimination of PCa patients
from those with benign disease or healthy individuals. Additionally, the KLK2 and PSMA
transcripts may also be used as prognostic markers for the presence of extra-capsular
disease and assisting in the prediction of the post-operative outcome.
CHAPTER III -
Purpose: Transcripts of PCA3/DD3 gene are at the moment the most specific molecule
found in prostate cancer specimens. This mRNA can be detected in important sample
targets for clinical analyses, such as prostatic tissues, urine after prostatic massage, and
the peripheral blood. Methods: The present study evaluated the PCA3 gene expression in
prostatic tissues and in peripheral blood of BPH and PCa patients, by RT-PCR assays,
and based on its detection together with other clinical parameters, we proposed a model
for molecular monitoring in order to improve diagnosis as an auxiliary technology. Results:
The concomitant use of PCA3 transcript detection in the peripheral blood and in prostate
tissues has improved diagnosis, with sensitivity and an accuracy of 77%. For the
molecular staging, patients have been classified as: localized disease (PBL-; negative
PCA3) and circulating tumors cells disease (PBL+; positive PCA3). The higher
frequencies of PBL- had been observed in T1-T2 stages (75%); on the other hand, the
higher PCA3 positivity was observed for the T3-T4 staging (43%), while the T1-T2 stages
presented 25% positivity. A correlation was found between the molecular staging and
serum PSA < 10ng/mL before surgery, and approximately 60% of patients with T3-T4
stages that presented biochemical failure after radical prostatectomy presented a positive
PCA3 result (P= 0.05), with an odds ratio of 16-fold higher for the possibility of disease
recurrence in relation to the T1-T2 patients, and an accuracy of 82%. Conclusion: These
data demonstrated the importance of the PCA3 gene as an auxiliary method in prostate
cancer diagnosis, by distinguishing PCa from BPH patients, and also demonstrated its
prognostic value in recurrent disease for post-operative patients.
CHAPTER IV -
Approximately 98% of all the products transcribed in the human genome correspond to
non coding RNAs (ncRNA). Many ncRNA functions are attributed to this structural
particularity given mainly for the secondary structures formed from its linear sequence of
bases. Among the ncRNA types are tRNA, rRNA, small nuclear RNA, small nucleolar
RNA, small interference RNA (siRNA), microRNA (miRNA) and catalytic RNAs
(ribozymes). The bioinformatics has supplied useful tools in the prediction of optimal or
suboptimal secondary structures allowing the design of interference RNA as miRNAs or
siRNAs. In human, miRNAs have been associated with the development of diverse
complex diseases as cancer. The PCA3 (DD3) gene was molecularly characterized as
cancer and prostate specific, and its transcripts are non-coding, once no peptide products
have been found. Due to its structural characteristics, the PCA3 gene belongs thus to the
increasing family of ncRNA. In the present work, four new variant molecules of the PCA3
gene have been sequence characterized and their frequencies demonstrated in prostate
cancer and in benign prostatic hyperplasia patients, as well as in healthy individuals. We
have also investigated and predicted the putative secondary structures formed in order to
elucidate its role in prostate cancer biology. No association has been found between the
frequency of these molecules and prostate pathologies (PCa or BPH). On the other hand,
PCA3 variants were found in 10% (12/115) of cases in the general population. Similar
analyses of the possible polypeptides of these molecules demonstrated that it remains as
a non-coding RNA, and introns presents in the first, second and fourth variants suggesting
a possible role as a miRNA with intracellular activity to these molecules to the PCA3 gene.
In prostatic tissues, 100% of the prostate cancer cases presented the RNA molecule with
an exon 2 splicing. However, further investigation must be carried out to demonstrate the
true role of these splicing variants in prostate tumors and in other pathologies, once these
molecules have been preferentially found in the peripheral blood. / CAPÍTULO I -
O câncer de próstata é uma doença comum no mundo e já assumiu em alguns
países uma das principais causas de mortalidade da população masculina. Vários
marcadores moleculares têm sido associados à gênese do câncer de próstata. A fim de
demonstrar a expressão diferencial dos níveis transcricionais dos genes AR, SRD5A2,
KLK2, PSMA e PCA3 em doenças prostáticas, o RNAm foi analisado em tecidos com
adenocarcinoma prostático (CaP, N= 48) e hiperplasia prostática benigna (HPB, N= 25)
por meio da técnica RT-PCR multiplex semi-quantitativa. Foram observadas diferenças
significativas na expressão relativa desses genes entre os tecidos cancerosos e nãocancerosos.
A taxa de densidade ótica entre os amplicons para cDNA provenientes do
gene AR foi 1.6 vezes maior no adenocarcinoma prostático. Por outro lado, os níveis de
RNAm do gene SRD5A2 foi associado com a HPB e foi 1.4 vezes maior do que no CaP.
Para os genes KLK2, PSMA e PCA3, os níveis transcricionais foram respectivamente,
1.9, 1.9 e 5 vezes maior no câncer comparado a tecidos benignos. Dos testes
diagnósticos realizados, o gene PCA3 individualmente foi o que apresentou as melhores
sensibilidade e acurácia, sendo que a inclusão das medidas de PSA sérico melhorou a
sensibilidade (de 76 para 92%), o valor preditivo positivo (de 85 para 94%), o valor
preditivo negativo (de 60 para 62%) e a acurácia (de 74 para 78%). Os dados sugerem
que a maior expressão dos genes AR, KLK2, PSMA e PCA3 ou expressão reduzida do
gene SRD5A2 em tecidos prostáticos podem indicar a ocorrência do adenocarcinoma da
próstata, sendo que as análises do gene PCA3 juntamente aos do PSA sérico são
altamente promissores como método auxiliar no diagnóstico desse tipo de câncer.
CAPÍTULO II -
O câncer de próstata (CaP) e o mais comumente diagnosticado na população masculina
e consiste de eventos multifatoriais e multifocais. Devido a complexidade da doença, a
qual inclui alterações genômicas, invasão local, liberação de células micrometastáticas
para a circulação, invasão secundaria de tecidos de outros órgãos, e resistência ao
bloqueio hormonal, muitos marcadores podem ser usados para representar os eventos
múltiplos e variáveis que levam ao desenvolvimento do câncer. A baixa especificidade do
único marcador para diagnostico do câncer de próstata, PSA, tem nos levado a investigar
quatro potenciais marcadores no sangue periférico de pacientes pela detecção de seus
níveis de RNAm e associá-los a parâmetros clínicos. Os níveis de expressão dos
transcritos do KLK2, KLK3, PCA3 e PSMA foram avaliados pela RT-PCR Nested, em
pacientes com CaP (99), com hiperplasia prostática benigna (HPB, 36) e voluntários
saudáveis (104). Diferenças significativas foram encontradas para a expressão dos genes
KLK2, PSMA e PCA3 entre os pacientes com CaP e os pacientes com HPB ou
voluntários saudáveis. Os níveis do KLK2 e PSMA também apresentaram associação
positiva (P<0.05) com doença extra-prostática (pT3). A RT-PCR Nested positiva
combinada para os genes KLK2, PCA3 e PSMA com PSA sérico maior que 4ng/mL
apresentou uma chance 10 vezes maior de ocorrência do câncer comparado aos
controles saudáveis, com sensibilidade, especificidade e acurácia de 57%, 89% e 93%,
respectivamente. A análise combinada dos genes KLK2, PCA3 e PSMA pode ser uma
ferramenta útil na distinção de pacientes com CaP daqueles com doença benigna ou de
indivíduos saudáveis. Ainda, a analise dos transcritos KLK2 e PSMA podem ser usados
como marcadores prognósticos para a presença de doença extra-capsular e auxiliando
na predição de recidiva da doença no pós-operatório.
CAPÍTULO III -
Os transcritos do gene PCA3/DD3 são até o momento as moléculas mais específicas
encontradas em espécimes de câncer de próstata. Esses RNAm podem ser detectados
em importantes alvos para a análise clínica como tecidos prostáticos, na urina após
massagem prostática e em sangue periférico. O presente estudo avaliou a expressão do
gene PCA3 em tecidos prostáticos e em sangue periférico de pacientes com HPB e CaP,
por técnicas de RT-PCR, e baseado na sua detecção juntamente com os parâmetros
clínicos, foi proposto um modelo de estadiamento molecular como técnica assessória
para melhor o diagnóstico da doença. O uso concomitante da detecção dos transcritos do
gene PCA3 no sangue periférico e no tecido prostático melhorou o diagnóstico, com
sensibilidade e acurácia de 77%. Para o estadiamento molecular, os pacientes foram
classificados como contendo a doença localizada (PBL-) e em doença com células
tumorais circulantes (PBL +). Maiores freqüências de tumor localizado pelo estadiamento
molecular foram observadas nos estadios T1-T2 (75%), enquanto que 25 e 43% dos
cânceres T1-T2 e T3-T4, respectivamente, apresentaram PCA3 positivo (células
circulantes). Uma correlação foi encontrada para o estadiamento molecular para doença
localizada e PSA sérico pré-cirúrgico < 10ng/mL, e aproximadamente 60% dos pacientes
TNM T3-T4 que apresentaram falha bioquímica após a cirurgia radical apresentaram RTPCR
positiva do PCA3 (P= 0.05), com um Odds Ratio 16 vezes maior para a
possibilidade de recorrência da doença em relação aos pacientes T1-T2 e uma acurácia
de 82%. Esses dados demonstram a importância da detecção do gene PCA3 como
método no diagnóstico do câncer de próstata, por distinguir pacientes com CaP daqueles
com HPB, e também demonstrando seu valor prognóstico na doença recorrente no pósoperatório
dos pacientes.
CAPÍTULO IV -
Aproximadamente 98% de todos os produtos transcritos do genoma humano
correspondem a RNAs não codificantes (RNAnc). Muitas funções dos RNAnc são
atribuídas a suas particularidades estruturais dadas principalmente pelas estruturas
secundárias formadas a partir da sua sequência linear de bases. Dentre os tipos de
RNAnc estão os RNAt, RNAr, small nuclear RNA, small nucleolar RNA, small interference
RNA (siRNA), microRNA (miRNA) e RNAs catalíticos (ribozimas). A bioinformática tem
fornecido ferramentas úteis na predição de estruturas secundárias ótimas ou subótimas
permitindo o design de RNAs de interferência como os miRNAs ou siRNAs. Em humanos,
os miRNAs tem sido associados ao desenvolvimento de diversas doenças complexas
como o câncer. O gene PCA3 (DD3) foi molecularmente caracterizado como câncer- e
próstata- específico e os seus RNAs são os responsáveis por essa característica, isso
porque nenhum produto protéico tem sido encontrado para esse gene. Devido às suas
características estruturais, o gene PCA3, pertence assim à crescente família de RNAnc.
No presente trabalho foi analisado as freqüências de quatro moléculas variantes do gene
PCA3, além das anteriormente reportadas, como também foram preditas as suas
estruturas secundárias na tentativa de elucidar o seu papel na biologia do câncer de
próstata. Nenhuma associação foi encontrada entre a freqüência dessas moléculas e as
patologias da próstata como hiperplasia benigna ou câncer, sendo que na população
geral analisada essas variantes foram encontradas em apenas 10% (12/115) dos casos.
As análises de homologia de possíveis polipeptídeos para essas moléculas demonstram
que permanece o papel de RNA não-codificante para o gene PCA3. Ainda, a presença de
introns nas variantes 1, 2 e 4 podem sugerir um papel intracelular de miRNA para essas
moléculas do gene PCA3. Nos tecidos prostáticos, 100% dos casos de câncer foi
representando pela molécula com splicing do exon 2. Contudo, para as variantes de
splicing, novas pesquisas deverão ser realizadas incluindo outras patologias além das
doenças prostáticas e outros tipos tumorais para verificar o real impacto dessas
moléculas, uma vez que foram encontradas preferencialmente no sangue periférico. / Doutor em Genética e Bioquímica
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_UFU:oai:repositorio.ufu.br:123456789/15771 |
| Date | 26 February 2007 |
| Creators | Neves, Adriana Freitas |
| Contributors | Goulart Filho, Luiz Ricardo, Ward, Laura Sterian, Gimba, Etel Rodrigues Pereira, Loyola, Adriano Mota, Arap, Marco Antonio |
| Publisher | Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica, UFU, BR, Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFU, instname:Universidade Federal de Uberlândia, instacron:UFU |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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