The development of the nervous system is highly dependent on the differentiation of various neuronal and glial cell populations, efficient targeting of axons, establishment of neuronal connections and continuous branching/pruning and establishment of new connections. These processes are possible through migration, adhesion and cytoskeletal rearrangement processes that are common in most organogenesis. The extracellular matrix and guidance molecules interact with cell surface receptors that transduce signaling mechanisms intracellularly allowing for these cellular responses to take place.Netrins are bifunctional chemotropic cues that attract or repel different classes of axons by signaling through the netrin receptors Deleted in Colorectal Cancer (DCC) and the UNC5 homologues (UNC5a, b, c and d) during the development of the nervous system. This family of chemotropic molecules is a member of the laminin superfamily. Similar to laminin-integrin signaling, netrin-1's interaction with its receptor DCC results in the activation of the Rho GTPases Rac and Cdc42 and the promotion of a signaling cascade that leads to growth cone cytoskeletal and membrane remodeling. This thesis focused on further identifying the signaling molecules and complexes downstream of DCC that are required for netrin-1 mediated commissural neuron axon chemoattraction.In the first part of this thesis we have used an unbiased mass spectrometry approach to identify signaling molecules complexed to DCC in commissural neurons isolated from E12/13 spinal cord. From the mass spectrometry data obtained we chose to characterize Arp2/3 and 14-3-3. Arp2/3 co-immunoprecipitated with DCC in commissural neuron in a netrin-1-dependent manner. We further established that netrin-1 mediated commissural growth cone expansion and filopodia remodeling is blocked by wiskostatin, a potent chemical inhibitor of N-WASP activity towards the Arp2/3 complex. The treatment of the neurons with wiskostatin also inhibited netrin-dependent externalization of DCC. These results suggest that actin polymerization resulting from N-WASP/Arp2/3 complexes may be required to maintain DCC cell surface recycling during netrin-1 mediated axon guidance. The 14-3-3 epsilon adaptor protein was also identified as a DCC associated protein. However, its association with DCC decreased with the addition of netrin-1. The inhibition of 14-3-3 function using a function-blocking peptide resulted in the collapse of commissural growth cones which could not be recovered by the addition of netrin-1. In the second part of this thesis we identified β-Pix as a potential GEF downstream of DCC involved in the activation and propagation of Rac-1 and Cdc42 signaling. We found that a β-Pix/Git complex associates with DCC in commissural neurons. β-Pix is highly expressed in the developing spinal cord in various neuronal subpopulations. Additionally functional assays using the overexpression of β-Pix mutants showed that β-Pix complexes and association with Pak are important steps in the maintenance of netrin-1 induced changes in GC morphology, in commissural axon extension to the midline, and for cortical neuron branching. Using modified GTPase assays we further demonstrated that β-Pix is required for Cdc42 and Rac-1 activation downstream of netrin-1 and is associated with the GTP-bound GTPases. β-Pix may associate with the GTPases by binding to Pak, or alternatively, may bind directly, as has been demonstrated for the related protein α-Pix, resulting in allosteric activation of the GTPase. These results support a novel model, in which β-Pix/Git complexes play an integral part in the activation of Rac-1 and Cdc42 downstream of DCC.These findings provide novel insight into the signaling events activated by netrin-1 downstream of DCC during commissural axon guidance. They have also identified new questions related to how signal transduction mechanisms activated by netrin-1 regulate the cytoskeleton of the axonal growth cone. / Le développement du système nerveux dépend en grande proportion en la différentiation de différentes populations de cellules neuronales et gliales, du guidage efficace des axones, de l'établissement de connexions neuronales et de ramification et élagage de ces nouvelles connexions. Ces procès sont possibles grâce à la migration, adhésion et réarrangement du cytosquelette, des mécanismes communs à l'organogénèse. Les Netrines sont des signaux chimiotropiques qui attirent ou bien repoussent différentes classes d'axones, par l'intermédiaire du récepteur Deleted in Colorectal Cancer (DCC) et des récepteurs UNC5 (UNC5a, b, c et d) pendant le dévelopement du système nerveux. Cette famille de molécules chimiotropiques partage une haute homologie avec la famille des laminines. De façon analogue à la signalisation laminine-intégrine, l'intéraction de la Netrine avec son récepteur DCC mène à l'activation des Rho-GTPases Rac-1 et Cdc42 et d'une cascade de signalisation qui mène au remodèlement du cytosquelète et de la membrane du cône de croissance. Cette thèse se concentre sur l'identification plus approfondie des molécules et complexes de signalisation en aval du récepteur DCC qui sont requis pour la chimio-attraction des axones des neurones comissuraux médiée par la Netrine. Dans la première partie de cette thèse nous avons utilisé une approche de spectrométrie de masse non biaisée pour identifier des molécules de signalisation complexées au récepteur DCC lié à la Netrine dans des neurones commissuraux isolés de moelle épinière à E12/E13. A partir des données de spectrométrie de masse nous avons choisi de caractériser Arp2/3 et 14-3-3. Arp2/3 a co-immunoprécipité avec DCC de façon dépendante de la Netrine. De plus nous avons démontré que l'expansion du cône de croissance et le remodelage des filopodes commissuraux sont bloqués par la Wiskostatine, un puissant inhibiteur de l'activité de N-WASP envers le complexe Arp2/3. De plus, le traitement aves la wiskostatine a inhibé l'externalisation dépendante de la Netrine du récepteur DCC. Ces résultats suggèrent que la polymérisation de l'actine résultant de complexes N-WASP/Arp2/3 peut être requise pour le maintient du recyclage de DCC à la surface de la cellule pendant le guidage axonal généré par la Netrine. La proteine adaptateur 14-3-3 epsilon a aussi été identifiée comme étant associée à DCC. Néanmoins, son association à DCC décroit suite à l'addition de Netrine. L'inhibition de 14-3-3 par l'utilisation d'un peptide bloqueur a eu comme résultat le collapse des cônes de croissance commissuraux, qui n'ont pas pu être récupérés par l'addition de Netrine. Dans la deuxième partie de cette thèse nous avons identifié ß-Pix comme un potentiel GEF en aval de DCC, impliqué dans l'activation et la propagation de la signalisation par Rac-1 et Cdc42. Nous avons déterminé qu'un complexe ß-Pix/Git s'associe avec DCC dans les neurones commissuraux. De plus, des essais fonctionnels utilisant la surexpression de mutants ß-Pix a montré que les complexes ß-Pix et l'association avec Pak sont des pas importants dans le maintient et la morphologie des cônes de croissance, l'extension des axones commissuraux vers la ligne médiane et la ramification des neurones corticaux éllicités par la Netrine. En utilisant des essais de GTPase modifiés nous avons aussi démontré que ß-Pix est requis pour l'activation de Cdc42 et Rac-1 en aval de la Netrine et qu'il est associé avec les GTPases liées à GTP. ß-Pix peut s'associer aux GTPases par l'intermédiaire de Pak ou, en alternative, peut se lier directement, tel que démontré pour la protéine proche α-Pix, menant à l'activation allostérique de la GTPase. Ces résultats supportent un nouveau modèle où des complexes ß-Pix/Git pourraient jouer un rôle intégral dans l'activation de Rac-1 et Cdc42 en aval de DCC. Ces données apportent de nouvelles avenues dans la signalisation en aval de DCC pendant le guidage des axones commissuraux.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.104490 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Rodrigues, Sonia |
| Contributors | Timothy E Kennedy (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Anatomy and Cell Biology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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