Proprotein convertases (PC) are proteases implicated in the regulation of mediators crucial for cancer growth and progression. The literature suggests that over-expression of some PCs contributes to tumorigenesis, invasion and metastasis in vivo; but evidence of the contrary also exists, where PC inhibition enhances cell migration and lung metastasis. The balance of these two opposing outcomes may determine the overall effect of specific PCs, resulting in cancers with increased or decreased aggressiveness. Preliminary data suggests that the expression of several PCs and a chaperone protein 7B2 is altered in human colorectal cancer (CRC) liver metastasis, and we hypothesize that the levels of active PCs in the primary CRC might predict progression and metastasis. To determine the effect of PCs (PACE4, PC5/6, PC7, Furin, PC1/3) and 7B2 in metastatic colon cancer cells, human CRC line HT-29 transfected with shRNA to the given genes was studied. The phenotypic differences of each downregulated PC and 7B2 cell lines was assessed for proliferation, using Ki67 detection; apoptosis, using Annexin V and caspase activity detection; and adhesion-independent growth, using soft agar assay. Comparison between HT-29 cell lines, and those expressing LKO (empty vector), NT (scrambled sequence), hPACE4, hPC5/6, hPC7, h7B2, hFur and hPC1/3 showed no difference in Ki67 expression (P=0.937) and Annexin V binding (0.838). There were significant differences in caspase activity (P=0.001) and colony growth in soft agar (P=0.001). Further analysis revealed lower caspase activity in cells expressing hPC5/6 (P=0.032) and higher in those hFur (P=0.032); cells expressing hPC5/6 showed greater growth potential in soft agar (P=0.001) compared to control.To determine a profile of PC expression in human tissue, data from 45 consented patients having had surgery for colon cancer primaries in 2004 at the MUHC (McGill University Health Centre), was gathered. A tissue microarray (TMA) of surgical specimens -- including colon (tumour and normal), lymph node (tumour where applicable, and normal) and where applicable, liver (tumour and normal) – was constructed. Immunohistochemical stains for PC1, PC2, PACE4, PC5/6, PC7, Furin and 7B2 will be performed; VEGF, MLH1 and MSH2 (known markers of poor prognosis in CRC) will also be stained to correlate with patient outcome.In vitro studies show altered CRC cell behaviour with altered PC profiles. Lower levels of PC5/6 expression decreased apoptotic activity and increased growth in soft agar. PC5/6 may therefore be protective against local tumour burden. Further studies evaluating invasive and metastatic potential are warranted. In addition, with its high throughput approach, the availability of a TMA will translate in vitro findings of this and future experiments, to the targeted and effective management of patients who suffer from colorectal cancer. / Les proprotéines convertases (PC) sont les enzymes protéolytiques impliquées dans la régulation des facteurs essentiels pour la croissance du cancer et sa progression. La littérature suggère que la surexpression de certaines PC contribue à la tumorigénèse, l'invasion et la métastase in vivo, mais la preuve du contraire existe aussi, où l'inhibition de PC promouvoit la migration cellulaire et les métastases pulmonaires. La difference entre ces résultats contradictoires pourrait déterminer l'effet global des PC spécifiques, résultant en cancers dont l'agressivité est soit augmentée ou diminuée. Les données préliminaires suggèrent que l'expression de plusieurs PC et une protéine chaperon 7B2 est altéré dans les métastases hépatiques des cancers colorecteaux humain (CRC), et nous faisons l'hypothèse que les niveaux de PC actifs dans le CRC primaire pourrait prédire la progression et la formation de métastases. Pour déterminer l'effet des PC (PACE4, PC5 / 6, PC7, furine, PC1 / 3) et 7B2 dans les cellules métastatiques du cancer du côlon, la lignée HT-29 transfectée avec le shRNA des gènes mentionnées a été étudiée. Les différences phénotypiques des lignées cellulaires dont l'expression des PC et 7B2 a été supprimé ont été évaluées pour la prolifération en utilisant la détection de Ki67; l'apoptose, en utilisant l'annexine V et l'analyse de l'activité caspases; et la croissance ancrage-indépendante, à l'aide de culture en agar mou. Comparaison entre les lignées HT-29, et ceux qui expriment LKO (vecteur vide), NT (séquence brouillée), hPACE4, hPC5/6, hPC7, h7B2, hFur et hPC1/3 n'ont montré aucune différence dans l'expression de Ki67 (p = 0,937) et annexine V (0.838). Il y avait des différences significatives dans l'activité des caspases (P = 0,001) et la croissance de colonies en agar mou (P = 0,001). Une analyse plus poussée a révélé une activité des caspases réduite dans les cellules qui exprimaient hPC5/6 (P = 0,032) et élevée chez les cellules exprimant hFur (P = 0,032). En plus, les cellules qui exprimaient hPC5/6 ont montré un plus grand potentiel de croissance en agar mou (P = 0,001) comparativement au contrôle. Afin de déterminer un profil d'expression PC dans les tissus humains, les données de 45 patients consentants ayant subi une chirurgie pour un cancer primaire du côlon en 2004 au MUHC (McGill University Health Centre), ont été recueillies. Un tissu microarray (TMA) des spécimens chirurgicaux - comprenant le côlon (tumeur et normal), les ganglions lymphatiques (tumeur, le cas échéant, et normal) et le cas échéant, le foie (tumeur et normal) - a été construit. Les colorations immunohistochimiques pour les PC1, PC2, PACE4, PC5 /6, PC7, furine et 7B2 sera effectuées; VEGF, MLH1 et MSH2 (marqueurs connus de mauvais pronostic pour CRC) seront également colorés et corrélés avec le pronostic des patients. Les études in vitro démontrent un comportement modifié des cellules CRC selon le profil de PC modifié. La suppression des niveaux de PC5/6 diminue l'activité apoptotique et augmente la croissance en agar mou. Cela peut suggérer que PC5/6 a un effet protecteur contre la charge tumorale locale. D'autres études évaluant le potentiel invasif et métastatique sont nécessaires. De plus, avec une approche productive, la disponibilité d'une TMA permettra de transposer les résultats des expériences actuelles et futures à la gestion ciblée et efficace des patients qui souffrent de cancer colorectal.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.107587 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Kwan, Janet |
| Contributors | Peter Metrakos (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Surgery) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
Page generated in 0.0022 seconds