Arsenic trioxide (ATO) is an effective treatment for acute promyelocytic leukemia (APL). While it is undergoing clinical trials for numerous malignancies including multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, lymphoma and solid tumors, it has demonstrated only limited efficacy as a single agent. However, it may hold promise as part of a combination therapy. Thus investigation to elucidate the mechanisms of action underlying these clinical responses may lead to generation of rational combination therapies to increase its therapeutic spectrum. Previous work has described a pathway required for ATO-induced apoptosis in APL cells involving the generation of reactive oxygen species (ROS), and the subsequent induction of a specific mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade that includes both stress-activated protein kinase (SAPK)/ERK kinase 1 (SEK1) and c-Jun N-terminal kinases (JNK) activation. However, the link between ROS production and activation of SEK1 remains to be elucidated. Apoptosis signaling kinase 1 (ASK1) is a MAP3K upstream of SEK1 that has been implicated in the induction of stress-induced signaling.Using murine embryonic fibroblasts (MEFs) derived from ASK1-/- mice; we provide evidence that ASK1 is a strong mediator for ATO-induced apoptosis and JNK activation. In an APL cell line, we show that ATO activates ASK1 in a dose- and time-dependent manner. However, knockdown of ASK1 in APL cells enhanced susceptibility to ATO, undergoing apoptosis and growth inhibition more than their wild type counterparts. The same impact was observed in the knockdown of SEK1, a direct downstream MAP2K of ASK1, and the knockdown of ASK1 in MCF-7 cells, a human breast cancer cell line. This led us to postulate that ASK1 had a pro-apoptotic function in non-transformed fibroblasts, but was pro-survival in malignant cells. Indeed, transformation of ASK1-/- MEFs restored their sensitivity to ATO-induced apoptosis and growth inhibition. Taken together, these results suggest that ASK1 can have both pro-apoptotic and anti-apoptotic roles depending on the transformation state of the cells.One model of ASK1 regulation suggests that ASK1 is kept in an inactive form by reduced thioredoxin-1 (Trx1). During oxidative stress, Trx1 is oxidized and releases ASK1 for activation. Immunoprecipitation of ASK1 followed by immuoblotting for Trx1 in APL cells shows a strong basal association that is lost with ATO treatment. Furthermore, the activity of thioredoxin reductase 1 (TrxR1), an enzyme that converts oxidized Trx1 into reduced Trx1, is significantly decreased following ATO treatment. This suggests that ATO activates ASK1 signaling by ROS-mediated oxidation of Trx1 and by maintaining Trx1 in its oxidized state by decreasing TrxR1 activity. In addition, we show that inhibition of TrxR1 with the TrxR1 inhibitor Auranofin sensitizes APL cells to ATO-induced apoptosis. Overall, our results suggest that targeting Trx1 may enhance ATO-induced apoptosis in a novel combination therapy. / L'arsenic trioxyde (ATO) est un traitement efficace contre la leucémie promyélocitaire aïgue (APL). Alors qu'il est testé dans le cadre de plusieurs essais cliniques sur différents cancers comme le myélome multiple, le syndrome myélodysplasique, le lymphome et les tumeurs solides, il ne montre qu'une efficacité limitée en tant qu'agent unique. Quoiqu'il en soit, il pourrait être prometteur au sein d'une thérapie combinée. Ainsi, l'étude des mécanismes d'action responsables des bénéfices cliniques apportés par l'arsenic trioxide pourrait mener à la mise au point de nouvelles thérapies combinées afin d'élargir le spectre thérapeutique d'ATO. Des travaux antérieurs ont décri une voix de signalisation, requise pour l'induction de l'apoptose par l'arsenic dans des cellules d'APL, qui implique la génération d'espèces actives de l'oxygène (ROS), ainsi que l'induction subséquente d'une cascade de protéine kinases mitogène-activées (MAPK) spécifique qui inclut à la fois la protéine kinase stress-activée (SAPK)/ERK kinase 1(SEK1) ainsi que l'activation de la kinase c-jun N-terminal (JNK). Néanmoins, le lien entre la production de ROS et l'activation de SEK1 reste à être élucidé. La kinase de signalisation de l'apoptose (ASK1) est une MAP3K en amont de SEK1 qui a été impliquée dans l'induction de la signalisation induite par le stress. En utilisant des fibroblastes d'embryions de souris (MEFs) dérivées de souris ASK-/-, nous montrons qu'ASK1 est un médiateur fort de l'apoptose et de l'activation de JNK par ATO. Dans une lignée cellulaire APL, nous montrons qu'ATO active ASK1 en fonction du temps et de la dose. Par contre, une sous-régulation d'ASK1 dans des cellules APL augmente la susceptibilité envers ATO, ce qui se traduit par une diminution de la croissance et une augmentation de l'apoptose par rapport aux cellules APL sauvages. Un impact similaire est observé lors d'une sous régulation de SEK1, une MAP2K directement en aval d'ASK1, ainsi que lors d'une sous régulation d'ASK1 dans des cellules MCF-7, des cellules de cancer du sein humain. Cela nous a conduit à postuler qu'ASK1 a une fonction pro-apoptotique dans les fibroblastes non-transformés, mais anti-apoptotique dans des cellules malignes. En effet, la transformation des cellules MEFs ASK-/- a restauré leur sensibilité envers l'arrêt de la croissance et l'apoptose induits par ATO, ce qui souligne les différences entre les cellules normales et les cellules transformées. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent qu'ASK1 a un rôle important dans la sensibilité à l'ATO qui dépend du contexte. Un des schémas de régulation d'ASK1 suggère qu'ASK1 est séquestré sous une forme inactive par la thioredoxine-1 réduite (Trx1). Durant le stress oxydatif, Trx1 est oxydée et libère ASK1 afin qu'il puisse être activé. L'immuno-précipitation d'ASK1 suivie d'un immuno-marquage for Trx1 dans des cellules APL montre une association basale forte qui est perdue lors du traitement avec ATO. De plus, l'activité de la réductase de la thioredoxine (TrxR1), une enzyme qui convertit Trx1 oxydée en Trx1 réduite, est diminuée de façon significative après traitement avec ATO. Cela suggère qu'ATO active la signalisation d'ASK1 en oxydant Trx1, via les ROS, ainsi qu'en inhibant la réduction de Trx1 en diminuant l'activité de TrxR1. De plus, nous montrons que l'inhibiteur de TrxR1, Auranofin, sensibilise les cellules APL à l'apoptose induite par ATO. Cela suggère que la régulation d'ASK1 dépend du statut redox de Trx1. Dans l'ensemble, nos résultats suggèrent que le fait de cibler Trx1 pourrait augmenter la signalisation d'ASK1 et l'apoptose induite par ATO au sein d'une nouvelle thérapie combinée.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114442 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Kwan, Stanley |
| Contributors | Koren Kathleen Mann (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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